胰腺癌干細胞生物學特性及增殖與分化調(diào)控的研究.pdf

1、第一部分、胰腺癌干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。 目的：研究人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1中腫瘤干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定方法。 方法：將PANC-1細胞進行培養(yǎng)，以CD44和CD24作為細胞表面標志。利用流式細胞儀，從該細胞株中分離出細胞亞群。通過裸鼠體內(nèi)接種成瘤實驗，鑒定各亞群細胞體內(nèi)增殖能力；通過S-P法檢測成瘤組織和PANC-1細胞株中CD44和CD24的表達，RT-PCR檢測CD44和CD24 mRNA的表達。 結(jié)

2、果：PANC-1細胞系在培養(yǎng)液I中培養(yǎng)時，CD44+和CD24+的表達分別為5.1％～17.5％和21.8％～70.1％，表型為CD44+CD24+的胰腺癌細胞僅占0.9％～3.5％，而在培養(yǎng)液II中培養(yǎng)，CD44+和CD24+的表達分別為5.9％～16.8％和19.5％～74.6％，CD44+CD24+為0.8％～4.1％。在兩種培養(yǎng)基中，細胞各表型的表達無統(tǒng)計學意義。裸鼠皮下植入5×103個CD44+CD24+亞群細胞，4周即可見明

3、顯的新生腫瘤塊(2/8)，而CD44-CD24-亞群，即使植入1×105個細胞，12周也難形成種植瘤。前者體外成瘤能力比后者至少強20～50倍（P<0.05或P<0.01）；所形成的腫瘤和PANC-1細胞系無組織學差異。實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示，同一培養(yǎng)基內(nèi)各組細胞均表達CD44和CD24mRNA，各組間CD44和CD24mRNA的表達值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；但不同培養(yǎng)基中，CD44和CD24mRNA的表達值差異性顯著(

4、P<0.01)。 結(jié)論：CD44和CD24可作為分選PANC-1中腫瘤干細胞的表面標志；分選出的CD44+CD24+亞群細胞具有腫瘤干細胞的特征。 第二部分、胰腺癌干細胞的生物學特性。 目的：初步了解胰腺癌干細胞生物學特性。 方法：采用MTT比色法檢測細胞體外增殖活性，利用流式細胞儀分析細胞周期，TRAP銀染法測定端粒酶活性。 結(jié)果：與CD44-CD24-亞群比較，CD44+CD24+亞群生長緩慢

5、，第7天才出現(xiàn)指數(shù)生長的趨勢，增殖能力較低，倍增時間更長，前者第5天已出現(xiàn)指數(shù)生長的趨勢。與對應的亞群細胞相比，CD44+、CD24+和CD44+CD24+細胞，無論S期比例，還是（S+G2/M）期比例都較低（P<0.05或P<0.01）。具有干細胞特性的CD44+CD24+細胞端粒酶活性比對應組要高得多。 結(jié)論：胰腺癌干細胞具有體外增殖能力較低，倍增時間較長，端粒酶活性高，處于相對靜止狀態(tài)等特性。 第三部分、Notch

6、1信號系統(tǒng)對胰腺癌干細胞增殖與分化的調(diào)控。 目的：探討激活的Notch1信號系統(tǒng)對胰腺癌干細胞增殖與分化的調(diào)控。 方法：向體外培養(yǎng)的胰腺癌干細胞中分別加入Notch1激活劑rhNF-κB和抑制劑γ-secretase inhibitor II(MW167)，空白對照加PBS緩沖液。RT-PCR、免疫印跡（Western blot）、流式細胞儀和免疫組化等方法檢測Notch1信號系統(tǒng)的表達。 結(jié)果：胰腺癌干細胞中有