超小超順磁氧化鐵標(biāo)記大鼠脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，特征性的病理改變是多巴胺神經(jīng)元凋亡和黑質(zhì)紋狀體通路損害，主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩和姿勢平衡障礙。隨著人口老齡化的加速，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，是威脅老年人健康的一類重大疾病，65歲以上人群發(fā)病率超過1％，給家庭和社會都造成了沉重的負(fù)擔(dān)。美國目前約有50萬PD患者，且每年以5萬例的速度遞增，而我國現(xiàn)已逐步進(jìn)入老

2、齡化社會，PD患者已達(dá)到200萬人，每年新增帕金森病患者近20萬人。若不及時進(jìn)行有效的治療，患者病情呈慢性進(jìn)行性加重，晚期往往全身僵硬、活動受限，約30％中晚期患者生活不能自理，最后常死于各種并發(fā)癥。目前無論是藥物治療還是手術(shù)治療只能暫時改善癥狀而不能阻止病情進(jìn)行性發(fā)展。隨著再生與組織工程醫(yī)學(xué)的興起，利用干細(xì)胞移植替代凋亡的多巴胺能神經(jīng)元成為治療PD一種新策略。
　　 干細(xì)胞移植作為治療中樞系統(tǒng)疾病的新治療策略而被廣泛研究。脂肪

3、源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stromal cells，ADSCs)是一種極具潛力的種子細(xì)胞，自Zuk于2001年發(fā)現(xiàn)以來，其生物學(xué)特性及分化潛能等方面與骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞非常相似，并且由于ADSCs具有來源豐富、易獲取、創(chuàng)傷小、增殖快等優(yōu)勢，使其成為一種更為理想的種子細(xì)胞。如何對移植的干細(xì)胞標(biāo)記及活體示蹤是近年的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，近年來，得益于分子影像學(xué)的快速發(fā)展為此提供了可能。磁共振成像（MRI）是目前臨床普遍應(yīng)用

4、成熟的影像學(xué)技術(shù)，但是常規(guī)MR成像的空間、時間分辨率無法顯示移植細(xì)胞，研究表明，借助新型磁共振造影增強(qiáng)劑可以反復(fù)無創(chuàng)地追蹤移植的干細(xì)胞。其中超小超順磁氧化鐵（ultrasmallsuperparamagnetic particles of ironoxide，USPIO）標(biāo)記是一種較為理想的MR示蹤方法。目前已有不少學(xué)者相繼報道利用超順磁氧化鐵顆粒(super-paramagnetic iron oxide，SPIO)可成功標(biāo)記細(xì)胞并對

5、其進(jìn)行示蹤，但關(guān)于ADSCs的標(biāo)記及USPIO示蹤還鮮有報道，如何提高標(biāo)記效率同時又減少標(biāo)記物對細(xì)胞的毒性是移植治療過程中的前提。本課題旨在探討USPIO對ADSCs的標(biāo)記的適宜濃度及示蹤。
　　 本研究擬采用超小超順磁氧化鐵(USPIO)對大鼠脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)進(jìn)行標(biāo)記，對比分析不同濃度的超小超順磁氧化鐵(USPIO)對ADSCs標(biāo)記的效率，并分別用CCK-8及Alamarblue方法對已標(biāo)記細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測，

6、探尋USPIO對ADSCs適宜的標(biāo)記濃度。為觀測已標(biāo)記ADSCs在PD模型大鼠體內(nèi)的存活、遷移提供了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第一部分:大鼠脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:建立大鼠脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，并對其形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測，為USPIO標(biāo)記ADSCs提供細(xì)胞來源。
　　 方法:
　　 1.大鼠脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)、純化、傳代
　　 大鼠脂肪源間充質(zhì)干

7、細(xì)胞的原代培養(yǎng):SD大鼠，體重120±20g，采用36g/L水合氯醛，按1ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉滿意后將大鼠擺俯臥位，固定四肢于平板上，剃除背部及腹部的鼠毛。置于超凈工作臺上，依次用碘酊、酒精消毒，將解剖器械盒、三個玻璃培養(yǎng)皿（加入冷PBS液）等依次排放在超凈臺上。嚴(yán)格無菌條件下操作，逐層分離組織，盡量減少出血及紅細(xì)胞污染，取出腎周脂肪組織，選取含血管較少的部分置于培養(yǎng)皿中，包裹好迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房。用無菌的0.0

8、1mmol/L磷酸緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗脂肪組織，盡量剔除軟組織和血管，然后置于青霉素瓶中用眼科剪剪碎;再用吸管將細(xì)碎的脂肪組織轉(zhuǎn)移至一次性離心管（15ml），加入0.075％的Ⅰ型膠原酶37℃振蕩消化30min～40min;含10％FBS的DMEM/F12等體積中和，100μmnylonmesh過濾后離心(1200g×10min)，棄上清，以含10％FBS的DMEM/F12重懸細(xì)胞，輕柔吹打制成單細(xì)胞懸液，混勻，細(xì)胞計數(shù)儀下計數(shù)后以

9、1×106/ml密度接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶;置于37℃、5％CO2飽和溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后全量換液，去除懸浮細(xì)胞。以后每2～3天半量換液一次，待細(xì)胞生長至70％～80％融合后傳代培養(yǎng)。
　　 2.脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞儀檢測
　　 取第3代ADSCs，將培養(yǎng)好的脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞吹打分離下來，收集于50ml離心管中，并以吸管輕輕吹打、將脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞吹散，250×g4℃離心5分鐘，棄上清;用

10、0.01mol/L的PBS10ml重懸細(xì)胞，清洗1～2次;用適量0.01mol/LPBS調(diào)整細(xì)胞濃度1×106個/ml，分裝于EP管中，共5管，每管1ml，分別做好標(biāo)記。分別加入抗鼠CD29-PE、抗鼠CD90-FITC、抗鼠CD44-FITC和抗鼠CD45-FITC流式抗體5ul，室溫避光孵育10min，0.01mol/LPBS清洗2遍，1000rmp離心5min，適量的0.01mol/LPBS重懸后用流式細(xì)胞儀檢測。
　　

11、結(jié)果：
　　 1.大鼠脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞呈貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)均一，呈鵝卵石樣，一周以后大多數(shù)脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞有胞漿突起，以梭形細(xì)胞為主，胞漿豐富、核大、核染色質(zhì)細(xì)、核仁明顯，可見細(xì)胞呈克隆樣生長。傳代后，于倒置顯微鏡下可見成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈平行排列生長或旋渦狀生長，在形態(tài)上很難與骨髓來源的MSC區(qū)別開來。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的第3代ADSCs的表型標(biāo)志CD44、CD90和CD29呈陽性表達(dá)

12、，CD90表達(dá)陽性率達(dá)92.76％，CD29表達(dá)陽性率達(dá)96.56％，CD44表達(dá)陽性率達(dá)91.05％;CD45呈陰性表達(dá)，表明ADSCs是比較均一的未分化干細(xì)胞。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)獲得的大鼠脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)純化和傳代及流式細(xì)胞儀鑒定，達(dá)到理想的純度，能夠滿足實(shí)驗(yàn)設(shè)計的需要，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分：USPIO-PLL復(fù)合物標(biāo)記ADSCs及其增殖能力的檢測
　　 目的:采用不同濃度的USPIO-P

13、LL復(fù)合物標(biāo)記ADSCs，并分別用CCK-8及Alamarblue兩種方法檢測細(xì)胞活力，用普魯士藍(lán)染色檢測標(biāo)記效率，尋求較為理想的標(biāo)記濃度，旨在為后續(xù)研究工作提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。
　　 方法:將實(shí)驗(yàn)分為八個組，即（200μg/ml組，150μg/ml組，100μg/ml組，50μg/ml組，25μg/ml組，12.5μg/ml組，陰性對照組和空白對照組）。采用USPIO與正電荷轉(zhuǎn)染劑PLL共培養(yǎng)方法制備USPIO-PLL復(fù)合物，將

14、不同濃度的USPIO-PLL復(fù)合物標(biāo)記ADSCs，置于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。每天定時在被檢組4個復(fù)孔中加入CCK-8和Alamarblue試劑各10μl，孵育1h后使用酶標(biāo)儀檢測OD值，連續(xù)檢測7天，整理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析。用普魯士藍(lán)染色檢查USPIO-PLL標(biāo)記ADSCs的效率。
　　 用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD)表示，方差齊時采用單因素方差分析和LSD的多重比較，不齊

15、時采用非參數(shù)檢驗(yàn)和Tunnett’sT3多重比較。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:ADSCs經(jīng)不同濃度的USPIO-PLL復(fù)合物標(biāo)記后經(jīng)酶標(biāo)儀測得OD值，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時采用單因素方差分析和LSD的多重比較，不齊時采用非參數(shù)檢驗(yàn)和Tunnett'sT3多重比較。在標(biāo)記的第1天，經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示方差齊性(F=1.211，P=0.335)，然后進(jìn)行單因素方差分析顯示濃度組之間的差異有

16、統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.049，P=0.019)，進(jìn)行LSD多重比較后發(fā)現(xiàn)空白對照組與其他組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其余各組之間兩兩比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明除空白對照組，各組之間是均衡一致的。各組OD值在第3天逐漸出現(xiàn)變化，經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示方差齊性(F=2.233，P=0.067)，然后進(jìn)行單因素方差分析顯示濃度組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.283，P＜0.01)，進(jìn)行LSD多重

17、比較后發(fā)現(xiàn)200μg/ml組各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明其細(xì)胞增殖已受到抑制。第5天，經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示方差齊性（F=0.911，P=0.515），然后進(jìn)行單因素方差分析顯示濃度組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=110.356，P＜0.01)，進(jìn)行LSD多重比較后發(fā)現(xiàn)200μg/ml組各組比較仍然存在顯著差異。至第7天，經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示方差齊性（F=1.111，P=0.388），然后進(jìn)行單因素方差分析

18、顯示濃度組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=149.746，,P＜0.01），進(jìn)行LSD多重比較后發(fā)現(xiàn)150g/ml組的細(xì)胞增殖也出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，200μg/ml組的細(xì)胞增殖明顯受到抑制，與各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而CCK-8和Alamarblue兩種方法檢測方法的結(jié)果一致表明:12.5μg/ml～100μg/ml不影響ADSCs的增殖能力和活力，可以安全有效地標(biāo)記脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞。USPIO濃度為50μg/ml時，ADSCs胞漿內(nèi)可見藍(lán)色