超順磁性氧化鐵促進(jìn)大鼠脂肪源性干細(xì)胞成骨分化的研究.pdf

1、目的：
　　1、探討超順磁性氧化鐵納米顆粒標(biāo)記ADSCs后，對其增殖和活力造成的影響。
　　2、SPIO標(biāo)記ADSCs后，加入成骨分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)ADSCs定向成骨分化，研究SPIO對ADSCs定向成骨分化所造成的影響。
　　3、研究SPIO對ADSCs表達(dá)成骨相關(guān)基因造成的影響。
　　方法：
　　1、分離SD大鼠ADSCs，進(jìn)行體外培養(yǎng)及傳代，倒置顯微鏡下動態(tài)觀察原代和傳代培養(yǎng)的ADSCs的生長形態(tài)、結(jié)構(gòu)變

2、化及比較各代之間的差異。
　　2、分別以CD34、CD44、CD45、CD90抗體標(biāo)記ADSCs，使用流式細(xì)胞儀檢測分析其細(xì)胞免疫表型。
　　3、將經(jīng)SPIO標(biāo)記的ADSCs設(shè)為實驗組，無SPIO標(biāo)記的ADSCs設(shè)為對照組，分別接種于24孔培養(yǎng)板中，接種密度為5×104個細(xì)胞/孔;使用手持式細(xì)胞計數(shù)儀在培養(yǎng)第1、2、3、4、5、6、7天分別對兩組細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并描繪生長曲線圖。
　　4、誘導(dǎo)ADSCs成骨分化:將實驗組

3、和對照組ADSCs接種子6孔板中，接種密度為3×104個細(xì)胞/孔;加入足夠的常規(guī)完全培養(yǎng)液，放在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;當(dāng)細(xì)胞融合至50％-70％時，小心吸去舊的培養(yǎng)液，每孔加入2ml的成骨分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)基（含0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μmol/L抗壞血酸），每隔2-3天更換新鮮的成骨分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化2-4周。
　　5、ALP活性測定:取成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14、21及28

4、d的兩組細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液后PBS液清洗2次，加入1ml PBS液，收集細(xì)胞，使用超聲波細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞，進(jìn)行凍結(jié)→融化→凍結(jié)→融化操作，再以離心半徑10 cm、3000r/min離心10min;吸取上清液移到新的試管作為樣品。向培養(yǎng)板內(nèi)添加100μl底物緩沖液和20μl樣品，震蕩器上充分振蕩1分鐘后，37℃下孵育15分鐘。添加80μl反應(yīng)終止液，震蕩器上充分振蕩1分鐘，用酶標(biāo)儀測量波長520nm處的吸光值OD值，并按試劑盒所提供的公式

5、計算各組ALP活性(金式單位/100 ml)。每組3個樣本。
　　6、茜素紅染色法檢測細(xì)胞外基質(zhì)礦化率:取成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7、14、21及28 d的兩組細(xì)胞爬片，吸去培養(yǎng)基，并用1×PBS洗3次，每次5min;加入2ml的4％中性甲醛固定4℃30分鐘;30分鐘后，吸去固定液，并用1×PBS漂洗3次，每次5 min;每孔加入1ml的0.1％茜素紅染液，37℃作用30 min;去除染色液，并用漂洗3次，每次5 min;自然干燥，中性樹

6、膠封片;置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積情況、拍照。
　　7、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)形成率計算:成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7、14、21及28 d，使用甲醛固定細(xì)胞并用茜紅素進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色。在倒置顯微鏡下，兩組隨機取4個100倍視野，用數(shù)碼相機記錄。在計算機上將數(shù)碼照片放大至14cm×11cm，打印于70g復(fù)印紙上，仔細(xì)剪取孔底部分，準(zhǔn)確稱其重量(S)，再剪下茜紅素染色陽性結(jié)節(jié)部分，準(zhǔn)確稱其重量(SI)，即成骨細(xì)胞誘導(dǎo)形成率(％)=SI/S

7、×100％。
　　8、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率:兩組細(xì)胞分別用1×Binding Buffer制成1×106細(xì)胞/ml的懸液，在5ml的培養(yǎng)管中加入100μl細(xì)胞懸液（約1×105個細(xì)胞）;加入5～15μg純化的重組AnnexinⅤ;輕輕混勻，室溫反應(yīng)15分鐘后每管加入5μlAnnexinⅤ-FITC和10μl PI;輕柔漩渦混勻，室溫避光處放置孵育15分鐘;各試驗管中再分別加入1×Binding Buffer400μl混勻后，室

8、溫避光5分鐘。1小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。
　　9、熒光定量RT-PCR檢測Runx2、Ocn、ALP和Opn基因轉(zhuǎn)錄水平:
　　(1)總RNA的提取(Trizol抽提法)
　　①取對照組和實驗組細(xì)胞接種于6孔板中，接種細(xì)胞量為1×105個細(xì)胞數(shù);進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化實驗后，分別按設(shè)計的時間點收集細(xì)胞:day0、day7、day14;
　?、跅壢ヅ囵B(yǎng)基，用1×PBS清洗一次，每孔中加入1ml Trizol試劑，水平

9、放置片刻，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面并裂解細(xì)胞，用移液槍吸頭吹打細(xì)胞數(shù)次使細(xì)胞充分溶解，吸取勻漿轉(zhuǎn)移至1.Sml離心管中;
　　③加入200μl氯仿，蓋上管蓋，用力搖晃15s，在30℃下孵育2-3min，在2～8℃下以不超過12000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘，使RNA分離;
　?、苋∫粋€不含RNA酶的1.5ml離心管，加入500μl異丙醇，將步驟3中的離心后上清液轉(zhuǎn)移到有異丙醇的1.5ml離心管中。用力搖晃混合均勻后

10、，在30℃條件下孵育10分鐘，然后在2～8℃下以不超過12000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘;可見RNA形成一膠片狀沉淀附著于試管壁和管底;
　　⑤移去上清懸液，加入1ml75％乙醇，翻轉(zhuǎn)離心管4-6次，旋渦振蕩混合樣品并在2-8℃下以不超過7500×g的離心力高速冷凍離心5min，洗脫RNA;
　　(2) RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA
　?、賕DNA去除反應(yīng):將模板RNA置于冰上解凍，按FastQuant cD

11、NA第一鏈合成試劑盒說明書配制gDNA去除反應(yīng)體系混合液;徹底混勻后離心，并置于42℃水中孵育3min，然后置于冰上放置。
　?、赗NA反轉(zhuǎn)錄:按FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合液;將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系加到gDNA去除步驟的反應(yīng)液中充分混勻，42℃孵育15min。再于95℃孵育3min后放置于冰上，得到的cDNA保存于-20℃用于后續(xù)實驗。
　　10、統(tǒng)計學(xué)方法:計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((

12、x)±s)表示，樣本均數(shù)間的兩兩比較采用t檢驗，各組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1、經(jīng)膠原酶消化法所收獲的原代SD大鼠ADSCs培養(yǎng)48h后細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞變?yōu)殚L梭形，較為扁平，呈成纖維樣細(xì)胞生長;原代細(xì)胞培養(yǎng)48小時候開始增殖，3～5d可達(dá)到增殖高峰，呈集落樣生長，在6～8d后達(dá)到80％左右融合。從第2代開始，細(xì)胞貼壁時間和增殖時

13、間較原代明顯加快.
　　2、流式細(xì)胞儀檢測顯示，絕大部分SD大鼠ADSCs具有CD44+/CD90+/CD34-/CD44-的表型，表明ADSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型，但與造血干細(xì)胞系和血管生成干細(xì)胞系干細(xì)胞有區(qū)別。
　　3、實驗組與對照組day1、day2、day3、day4、day5、day6、day7生長曲線均呈S型，第1-2天細(xì)胞增殖處于潛伏期，從第3天起細(xì)胞開始進(jìn)入對數(shù)生長期。統(tǒng)計學(xué)分析表明:day2的細(xì)胞數(shù)量

14、在實驗組和對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而day3、day4、day5、day6、day7的細(xì)胞數(shù)量在實驗組和對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組。說明標(biāo)記SPIO后，ADSCs增殖能力不僅沒有受到抑制，反而有明顯增強。
　　4、ALP在第7天時已具備明顯活力，到第21天時到達(dá)高峰，隨后維持高水平至第28天。自第7天起各個檢測點(誘導(dǎo)7、14、21、28d)，實驗組與對照組ALP活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05

15、)，提示標(biāo)記SPIO后，ALP活性增加。
　　5、成骨誘導(dǎo)分化7d時，實驗組ADSCs細(xì)胞外開始出現(xiàn)細(xì)小礦化結(jié)節(jié)，并且隨著誘導(dǎo)時間延長，礦化結(jié)節(jié)增多、增大。誘導(dǎo)14d時，實驗組與對照組均形成明顯礦化結(jié)節(jié)，28 d達(dá)高峰，細(xì)胞外有大量鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)，但標(biāo)記有SPIO的實驗組ADSCs礦化結(jié)節(jié)明顯增多、增大，結(jié)節(jié)中心有大量鈣鹽沉積。
　　6、自第7天起，標(biāo)記SPIO后，ADSCs成骨細(xì)胞誘導(dǎo)形成率在實驗組和對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，

16、實驗組明顯高于對照組，說明SPIO能促進(jìn)ADSCs的成骨分化進(jìn)程。
　　結(jié)論：
　　1、經(jīng)膠原酶消化法所收獲的SD大鼠原代ADSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型，增殖能力良好，傳代細(xì)胞生物學(xué)特性穩(wěn)定。
　　2、標(biāo)記SPIO后，能促進(jìn)ADSCs增殖，不影響其細(xì)胞凋亡率，同時提高了ALP活性，增加了細(xì)胞外基質(zhì)礦化結(jié)節(jié)形成率及成骨細(xì)胞誘導(dǎo)形成率。
　　3、不論有無標(biāo)記SPIO，使用間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液，能將第三代

17、的ADSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。
　　4、SPIO能通過增強成骨相關(guān)基因Runx-2、Ocn、ALP和Opn的表達(dá)，促進(jìn)ADSCs的成骨分化。
　　5、本研究的不足之處:①應(yīng)該進(jìn)一步行普魯士蘭染色及透視電鏡檢測，以證實SPIO顆粒位于ADSCs細(xì)胞胞漿內(nèi)及了解SPIO在細(xì)胞內(nèi)分布情況，顯示共培養(yǎng)的可靠性。②需要進(jìn)一步了解經(jīng)SPIO標(biāo)記的ADSCs成骨分化后，使用免疫組化及蛋白免疫印跡方法檢測細(xì)胞內(nèi)Runx-2、Ocn、ALP和O