黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的肺癌進(jìn)展的影響及機(jī)制.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤之一，也是對(duì)人類生存和健康構(gòu)成極大威脅的惡性腫瘤。在我國(guó)，肺癌也已成為惡性腫瘤的頭號(hào)殺手。吸煙是肺癌發(fā)病的一個(gè)重要誘因，大約80％的男性患者和50％的女性患者都有吸煙史。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心等部門發(fā)布的《控?zé)熍c中國(guó)未來》顯示，2002年至2010年中國(guó)煙民的數(shù)量一直保持在3億以上。到2030年，中國(guó)因吸煙而導(dǎo)致的年死亡人數(shù)將達(dá)到300萬，占40歲以上人群死亡歸因總數(shù)的25％。因此，對(duì)吸煙誘發(fā)的肺癌的防治是目

2、前研究的重點(diǎn)。尼古丁是煙草中的主要成癮性組分，其能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，通過多種途徑加速肺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)雖無肺癌這一病名，但古代醫(yī)家對(duì)其癥狀、病因、病機(jī)等早有描述，并認(rèn)為“煙為辛熱之魁”，火熱是煙致肺積的重要病機(jī)。中醫(yī)藥治療肺癌具有緩解癥狀、改善生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期、配合放化療減毒增效以及防止轉(zhuǎn)移的作用。黃芩是傳統(tǒng)的清熱中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。黃芩中主要的黃酮類組分黃

3、芩苷、黃芩素和漢黃芩素具有廣泛的抗腫瘤活性。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)黃芩黃酮類組分對(duì)多種肺癌細(xì)胞株均有抑制作用，但黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的肺癌進(jìn)展的影響尚未見報(bào)道。為此本研究將就黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的肺癌進(jìn)展的作用及機(jī)制進(jìn)行研究，并以補(bǔ)腎組分淫羊藿苷作為對(duì)照，將為黃芩黃酮類組分抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供客觀而科學(xué)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為肺癌的臨床治療提供新的有效藥物和優(yōu)選方案，從而為肺癌的臨床治療開辟新的有效途徑。本課題研究?jī)?nèi)容分為三部分。

4、>　　第一部分黃芩黃酮類組分對(duì)人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　目的:
　　1.觀察黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞株A549和H1299的生物學(xué)效應(yīng);
　　2.探討黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞株A549和H1299凋亡的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.將人肺癌細(xì)胞株A549和H1299細(xì)胞分別暴露于尼古?。ńK濃度為10-8M和10-6M）和不同濃度的黃芩苷、黃芩素、漢

5、黃芩素和淫羊藿苷（終濃度為50μM、10μM、1μM和10μM）中，觀察黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，以CCK-8法檢測(cè)黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞增殖的影響，以流式細(xì)胞術(shù)觀察黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞凋亡的影響;
　　2.以Real-time PCR法和Western blot法檢測(cè)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和H1299細(xì)

6、胞中凋亡相關(guān)基因和蛋白bcl-2、bax和pro-caspase3的變化情況，以進(jìn)一步明確黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.黃芩黃酮類組分能顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞增殖，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著。黃芩黃酮類組分作用后的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)，AnnexinⅤ聯(lián)合PI法染色結(jié)果進(jìn)一步明確了黃

7、芩黃酮類組分的促凋亡作用，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的早期凋亡率分別是6.90±0.40、19.63±1.23和22.5±3.22，對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的H1299細(xì)胞的早期凋亡率分別是11.82±2.73、14.04±4.27和12.55±2.74，與尼古丁組均有顯著性差異。而淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導(dǎo)的H1299細(xì)胞增殖和凋亡，早期凋亡率與尼古丁組無顯著性差異;
　　2.黃芩黃酮類組分作用于人肺癌A549細(xì)胞4

8、8h后，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素可顯著抑制bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)，黃芩苷顯著抑制bax mRNA表達(dá)，但對(duì)bax蛋白表達(dá)無影響，漢黃芩素顯著促進(jìn)bax mRNA表達(dá)，黃芩素和漢黃芩素均促進(jìn)bax蛋白表達(dá)，黃芩素和漢黃芩素顯著抑制bcl-2/bax mRNA比值和pro-caspase-3 mRNA表達(dá)，三者均顯著抑制bcl-2/bax和pro-caspase-3蛋白表達(dá)。黃芩黃酮類組分作用于人肺癌H1299細(xì)胞48h后，黃芩苷、

9、黃芩素和漢黃芩素可顯著抑制bcl-2、bax和pro-caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)，黃芩素顯著抑制bcl-2/bax mRNA比值，但三者均對(duì)bcl-2/bax蛋白比值無影響。淫羊藿苷可促進(jìn)bcl-2 mRNA表達(dá)，但對(duì)bax mRNA、caspase-3 mRNA和bcl-2/bax mRNA比值以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)無影響。
　　第二部分黃芩黃酮類組分對(duì)人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和炎癥微環(huán)境的影響

10、>　　目的:
　　1.觀察黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響;
　　2.觀察黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的肺癌炎癥微環(huán)境的影響;
　　3.探討黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的肺癌侵襲轉(zhuǎn)移和炎癥微環(huán)境的影響機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和淫羊藿苷（終濃度為50μM、10μM、1μM和10μM）對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞遷移的影響。采用Tra

11、nswell侵襲實(shí)驗(yàn)研究黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞侵襲能力的影響;
　　2.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)研究黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞TNF-α和IL-6的影響;
　　3.采用Real-time PCR法和Western blot法檢測(cè)黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中MMP-2、M

12、MP-9、NF-κBp65和IκB-α mRNA和蛋白的影響。
　　結(jié)果:
　　1.黃芩黃酮類組分能顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均顯著下調(diào)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2和MMP-9mRNA表達(dá)，黃芩素和漢黃芩素明顯抑制A549細(xì)胞的MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，三種黃芩黃酮類組分均明顯抑制H1299細(xì)胞的

13、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)。淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導(dǎo)的H1299細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，對(duì)MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)亦無影響;
　　2.黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的兩種肺癌細(xì)胞株的炎癥微環(huán)境具有顯著地抑制作用。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均能抑制A549細(xì)胞IL-6和TNF-α表達(dá)和H1299細(xì)胞TNF-α表達(dá)，黃芩苷和黃芩素能抑制H1299細(xì)胞IL-6表達(dá)。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均抑制A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中NF

14、-κB p65mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)H1299細(xì)胞的IκB-αmRNA和蛋白表達(dá)，但對(duì)A549細(xì)胞的IκB-α mRNA和蛋白表達(dá)無影響。淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導(dǎo)的H1299細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)，對(duì)H1299細(xì)胞的NF-κB p65和IκB-α mRNA和蛋白表達(dá)亦無影響。
　　第三部分黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的小鼠Lewis肺癌移植瘤的作用及機(jī)制
　　目的:
　　探討黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的小鼠Le

15、wis肺癌移植瘤的抑瘤作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.60只C57小鼠接種Lewis肺癌細(xì)胞，一周后將荷瘤鼠隨機(jī)分為6個(gè)組，每組10只:對(duì)照組、尼古丁組、尼古丁+黃芩苷80mg/kg組、尼古丁+黃芩素40mg/kg組、尼古丁+漢黃芩素40mg/kg組和尼古丁+淫羊藿苷50mg/kg組。從分組后一周開始除對(duì)照組和尼古丁組給予生理鹽水灌胃外，其余各組給予相應(yīng)藥物灌胃，每天1次，共28天。從分組后兩周開始除對(duì)照組外，其余各組給

16、予尼古丁1mg/kg腹腔注射，每周3次，共3周。末次用藥后處死小鼠，處死前用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b)，計(jì)算瘤體體積V=a×b2/2。處死后小心剝離種植瘤，將瘤體稱重。
　　2.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)研究黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的Lewis肺癌小鼠移植瘤的VEGF、TNF-α和IL-6的影響;
　　3.采用Western blot法檢測(cè)黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的Lewis

17、肺癌小鼠移植瘤的bcl-2、bax和caspase-3蛋白表達(dá)的影響;
　　4.采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的Lewis肺癌小鼠移植瘤的CD31和NF-κB p65表達(dá)的影響，通過CD31表達(dá)計(jì)算腫瘤微血管密度(MVD)。
　　結(jié)果:
　　1.黃芩黃酮類組分可顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的肺癌移植瘤增殖，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均能抑制尼古丁誘導(dǎo)的凋亡轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白b

18、cl-2和caspase-3表達(dá)，下調(diào)bcl-2/bax比值，漢黃芩素能促進(jìn)尼古丁誘導(dǎo)的bax蛋白表達(dá)。淫羊藿苷雖能抑制bcl-2表達(dá)，上調(diào)bax表達(dá)，下調(diào)bcl-2/bax比值，但不能抑制caspase-3表達(dá)，對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的瘤體積和瘤重?zé)o影響;
　　2.漢黃芩素能顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的肺癌移植瘤的微血管生成，而黃芩素對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的腫瘤新生血管形成無影響，黃芩苷則促進(jìn)尼古丁誘導(dǎo)的腫瘤微血管生成。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均能顯著抑制

19、尼古丁誘導(dǎo)的肺癌移植瘤的VEGF表達(dá)。淫羊藿苷雖可抑制尼古丁誘導(dǎo)的腫瘤微血管密度，但對(duì)VEGF表達(dá)無影響;
　　3.黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的肺癌移植瘤的炎癥微環(huán)境具有顯著地抑制作用。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均能抑制IL-6表達(dá)，黃芩苷和黃芩素能抑制TNF-α表達(dá)。三種黃芩黃酮類組分均能抑制瘤組織中NF-κB表達(dá)。淫羊藿苷雖能抑制尼古丁誘導(dǎo)的瘤組織NF-κB表達(dá)，但對(duì)IL-6和TNF-α表達(dá)無影響。
　　結(jié)論:
　　

20、1.黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞均有明顯的抑制作用，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著。黃芩黃酮類組分可顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因和蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，降低bcl-2/bax比值，下調(diào)Pro-caspase-3的表達(dá)，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　2.黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲均有顯著地抑制作用，尤以黃芩素和漢

21、黃芩素作用更為顯著，其機(jī)制可能與下調(diào)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白如MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。
　　3.黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的炎癥微環(huán)境具有顯著地抑制作用，表現(xiàn)為抑制IL-6和TNF-α表達(dá)，其機(jī)制可能與抑制兩種細(xì)胞的NF-κB p65蛋白表達(dá)，上調(diào)H1299細(xì)胞的IκB-α蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　4.黃芩黃酮類組分可顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的肺癌移植瘤增殖，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著，其機(jī)制

22、可能與下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和caspase-3表達(dá)，下調(diào)bcl-2/bax比值，最終導(dǎo)致黃芩黃酮類組分對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的肺癌移植瘤的促凋亡作用有關(guān)。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的肺癌移植瘤的微血管生成的作用分別為促進(jìn)、無影響和抑制，但三者均能顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的肺癌移植瘤的VEGF表達(dá)。此外，黃芩黃酮類組分對(duì)尼吉丁誘導(dǎo)的肺癌移植瘤的炎癥微環(huán)境具有顯著地抑制作用，表現(xiàn)在抑制IL-6和TNF-α表達(dá)，其機(jī)制可能與抑制瘤組織中NF-

23、κB表達(dá)有關(guān)。
　　5.在體外實(shí)驗(yàn)中，淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導(dǎo)的H1299細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡，亦對(duì)凋亡下游信號(hào)無影響;淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導(dǎo)的H1299細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，亦對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)無影響;不能抑制尼古丁誘導(dǎo)的IL-6和TNF-α表達(dá)，對(duì)NF-κB p65和IκB-α表達(dá)的影響與尼古丁組亦無影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，淫羊藿苷雖能抑制bcl-2表達(dá)，上調(diào)bax表達(dá)，下調(diào)bcl-2/bax比值，但不能抑制caspase-