P2X7r調(diào)控AQP4表達(dá)在HBOP機(jī)制中的作用.pdf

1、背景和目的:
　　腦缺血性疾病占腦血管疾病總數(shù)的90％以上,如何提高腦組織對(duì)缺氧的耐受,減輕缺血后神經(jīng)及功能損傷,一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。本課題前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高壓氧預(yù)適應(yīng)(hyperbaric oxygen preconditioning,HBOP)對(duì)脊髓損傷、腦缺血都表現(xiàn)出了積極的保護(hù)作用,但其具體作用機(jī)制尚不明確。
　　P2X7r(P2X7 receptor)是ATP門(mén)控離子通道家族中的獨(dú)特亞型,廣泛分布于腦

2、組織細(xì)胞,P2X7r作為上游調(diào)節(jié)位點(diǎn),在神經(jīng)系統(tǒng)參與多種功能活動(dòng),在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用。AQP4是膜水通道蛋白,在血腦屏障(blood brain barrier, BBB)的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突高度表達(dá),是星形膠質(zhì)細(xì)胞上最為主要的功能蛋白,與水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。AQP4的調(diào)控影響著B(niǎo)BB的通透性變化,同樣在缺血缺氧腦水腫的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演重要角色。
　　課題前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分發(fā)現(xiàn),HBOP能通過(guò)下調(diào)P2X7r和AQP4蛋白

3、的表達(dá)起到對(duì)小鼠MCAO模型的保護(hù)作用。應(yīng)用P2X7r的激動(dòng)劑BzATP在MCAO之前對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理,能上調(diào)AQP4表達(dá),加重實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)功能損傷。這說(shuō)明P2X7r對(duì)AQP4具有調(diào)控作用。因此本課題在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以離體培養(yǎng)的大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象,探討HBOP對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(oxygen glucose deprivation)OGD模型的缺氧保護(hù)作用,并著重研究P2X7r對(duì)AQP4的調(diào)控及其在HBOP抗細(xì)胞缺氧損傷

4、機(jī)制中的重要地位。
　　方法:
　　1.選擇出生3天以內(nèi)的新生大鼠,從大腦中分離星形膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn),培養(yǎng)出純度高且能穩(wěn)定傳代的星形膠質(zhì)細(xì)胞,進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。
　　2.傳代后的細(xì)胞分為4個(gè)組:對(duì)照組(control)、高壓氧預(yù)適應(yīng)組(HBOP)、單純?nèi)毖踅M(OGD)、高壓氧預(yù)適應(yīng)缺氧組(HBOP+OGD)。按既定方案進(jìn)行細(xì)胞處理后,分別檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解液的化學(xué)發(fā)光度值,細(xì)胞凋亡率,并

5、運(yùn)用Western Blot和QT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞在預(yù)定時(shí)相點(diǎn)P2X7r及AQP4的蛋白及mRNA表達(dá)情況。
　　3.細(xì)胞分為8個(gè)組:HBOP組、HBOP+BBG組、HBOP+BzATP組、HBOP+BBG+BzATP組、HBOP+OGD組、HBOP+BBG+OGD組、HBOP+BzATP+OGD組、HBOP+BBG+BzATP+OGD組(BzATP和BBG分別為P2X7r的激動(dòng)劑與拮抗劑)。按既定方案進(jìn)行細(xì)胞處理后,進(jìn)行

6、細(xì)胞凋亡率檢測(cè),并運(yùn)用Western Blot和 QT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞在預(yù)定時(shí)相點(diǎn)P2X7r及AQP4的蛋白及mRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.培養(yǎng)出的星形膠質(zhì)細(xì)胞高度表達(dá)GFAP抗體,細(xì)胞計(jì)數(shù)分析顯示純化度高達(dá)95%;
　　2.HBOP具有明確的細(xì)胞缺氧保護(hù)作用;應(yīng)用P2X7r的激動(dòng)劑BzATP可削弱這種保護(hù)力度,加重缺氧損傷,BBG可部分拮抗BzATP的負(fù)效應(yīng);
　　3.HBOP可上調(diào)離體培養(yǎng)大

7、鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的P2X7r表達(dá),降低AQP4蛋白表達(dá)水平;在進(jìn)行OGD處理后,OGD組細(xì)胞的P2X7r和AQP4蛋白表達(dá)在缺氧6h即達(dá)到高峰,此后變化不大;而HBOP+OGD組細(xì)胞的P2X7r和AQP4蛋白表達(dá)在缺氧6h下調(diào),此后升高,在缺氧12h時(shí)達(dá)到高峰,總體呈先降后升的趨勢(shì)。QT-PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果基本一致;
　　4.在正常條件下,應(yīng)用BzATP后,P2X7r表達(dá)水平增加,AQP4表達(dá)減弱,應(yīng)用BBG

8、后,P2X7r表達(dá)下調(diào),而AQP4的表達(dá)增加;在缺氧環(huán)境中,應(yīng)用BzATP能同時(shí)上調(diào)P2X7r和AQP4的表達(dá),應(yīng)用BBG能同時(shí)下調(diào)P2X7r和AQP4的表達(dá);BzATP的激動(dòng)劑作用能被BBG部分拮抗。
　　結(jié)論:
　　1.HBOP處理能有效降低OGD細(xì)胞的凋亡率,具有明確的缺氧保護(hù)作用;
　　2.HBOP通過(guò)延遲OGD細(xì)胞的P2X7r和AQP4蛋白表達(dá)高峰起到細(xì)胞缺氧保護(hù)作用;
　　3.BzATP能拮抗HBOP