p38通路在液壓沖擊傷性腦水腫AQP4表達變化中作用.pdf

1、第一部分:大鼠液壓沖擊傷性腦水腫p38MAPK表達規(guī)律及其與AQP4表達變化的關系
　　 目的:觀察大鼠液壓沖擊傷性腦水腫p38MAPK表達規(guī)律及其與AQP4表達變化的關系。
　　 方法:雄性SD大鼠56只,體重250～300g,隨機分為對照組(NC組)和外傷組(TBI組),其中TBI組又按傷后1h,6h,12h,24h,3d,7d六個時間點分為6個亞組,每組8只。TBI組動物常規(guī)麻醉開顱,制作液壓沖擊傷動物模型;NC組

2、只行顱骨開窗但不給予液壓打擊。
　　 NC組于術后,TBI組于術后相應時間點進行神經功能評分后,再均以10％水合氯醛過度麻醉,斷頭處死,開顱取腦,經損傷區(qū)切成3mm厚冠狀腦片,HE染色行組織形學觀察,免疫組織化學染色方法檢測AQP4、p38MAPK和p-p38MAPK。從損傷區(qū)前緣取100mg左右腦組織應用干濕重法測腦組織含水量。損傷區(qū)后緣腦組織矢狀分為2部分,其中一份用Western Blot檢測AQP4,p38MAPK和p-

3、p38MAPK含量。另一份用RT-PCR檢測AQP4mRNA的表達。
　　 結果:
　　 1.神經功能評分:TBI組與NC組比較,在傷后6h評分開始減低(2.875±1.126,P＜0.05);12h(4.375±0.916)較6h有所升高,但仍低于NC組(P＜0.05);24h時評分又出現降低(2.125±0.835,P＜0.05);之后評分逐漸升高,3d神經功能評分(5.75±0.886,P＜0.05)仍低于NC組。

4、
　　 2.組織學觀察:TBI組動物動物傷后6h開始出現細胞水腫,12h細胞水腫較前加重,24h時水腫最為明顯,可見細胞體積明顯增大,胞漿淡染,甚至出現空泡變性,并伴有膠質細胞的增生,3d時水腫程度有所減輕,7d時明顯減退,但膠質細胞增生逐漸顯著。
　　 3.大鼠腦含水量
　　 TBI組與NC組相比,1h時差異無統計學意義(P＞0.05),6h時稍升高(79.54±0.715,P＜0.05),12h明顯升高(81

5、.89±0.581,P＜0.05),24h達到高峰(83.31±1.115,P＜0.05),3d開始下降(82.13±0.593,P＜0.05),7天明顯下降(81.24±1.010,P＜0.05)。
　　 4.免疫組化
　　 AQP4主要在星形膠質細胞和室管膜細胞胞膜表達,尤其豐富表達于與毛細血管和軟腦摸直接接觸的星形膠質細胞足突上。TBI組動物水腫腦組織AQP4于傷后6h(0.424±0.021,P＜0.05)開始增

6、高,24h(0.909±0.052,P＜0.05)達到高峰,隨后逐漸降低。p38MAPK在神經元和神經膠質細胞都有表達,尤其在腦室兩側和脈絡叢表達明顯,在液壓沖擊腦損傷后隨著時間延長其表達逐漸增強,12h(0.400±0.034,P＜0.05),24h(0.585±0.026,P＜0.05),3天(0.746±0.040,P＜0.05),7天(0.917±0.040,P＜0.05)。P-p38MAPK則主要表達于細胞核,在正常腦組織中幾

7、乎不表達,液壓沖擊腦損傷后其表達升高,且變化趨勢與AQP4變化趨勢相似,6-12h(0.292±0.022,0.499±0.019,P＜0.05)逐漸升高,24h(0.911±0.049,P＜0.05)達高峰,3天后出現下降(0.666±0.037,P＜0.05)。
　　 5. Western Blot.
　　 TBI組與NC組相比,TBI組動物水腫腦組織AQP4蛋白表達從6h開始增高(1.639±0.161,P＜0.0

8、5),12h(2.303±0.211,P＜0.05),24h達到高峰(2.822±0.150,P＜0.05),3d時降低(2.112±0.195,P＜0.05),7d后明顯降低(1.554±0.199),但仍高于正常(P＜0.05)。
　　 與NC組相比,TBI組動物水腫腦組織P-p38MAPK表達于6h開始逐漸增高(1.581±0.146),24h達到高峰(2.178±0.124,P＜0.05),3d時降低(1.913±0.1

9、61,P＜0.05),7d后明顯降低(1.673±0.100),但仍高于正常(P＜0.05)。
　　 與NC組相比,TBI組動物水腫腦組織p38MAPK表達隨時間延長其表達逐漸升高,6h(1.417±0.123),12h(1.755±0.079,P＜0.05),24h(2.082±0.106,P＜0.05),3d(2.211±0.107,P＜0.05),7d(2.373±0.064,P＜0.05)
　　 6. RT-PC

10、R
　　 TBI組動物水腫腦組織AQP4mRNA的表達從1h(0.186±0.016)開始增高,6h為(0.422±0.039,P＜0.05),12h繼續(xù)升高(0.620±0.068,P＜0.05),24h至3d達到高峰(1.060±0.140,0.739±0.109,P＜0.05),7d后降低(0.429±0.088),仍高于對照組(P＜0.05)。各亞組間比較均有差異(P＜0.05)。
　　 6腦含水量與AQP4mR

11、NA、AQP4蛋白和p-p38MAPK表達相關性分析
　　 TBI組大鼠腦含水量隨AQP4及其mRNA表達的升高而增加,腦含水量與AQP4蛋白及其mRNA之間呈明顯正相關(rwestem blot=0.904,r免疫組化=0.935;rm=0.924.,P＜0.01)。
　　 TBI組大鼠腦含水量隨P-p38MAPK表達增加而增加,腦含水量與p-p38MAPK之間呈明顯正相關(r免疫組化=0.949,rwestem bl

12、or=0.969,P＜0.01)。
　　 AQP4表達隨p-p38MAPK表達增加而增加,p-p38MAPK與AQP4蛋白及其mRNA表達變化之間都呈明顯正相關(r免疫組化=0.978;rwesternblot=0.943,P＜0.01)。
　　 結論:
　　 1.大鼠液壓沖擊傷性腦水腫AQP4及其mRNA表達呈升高趨勢。
　　 2.大鼠液壓沖擊傷激活p38MAPK通路,p-p38MAPK表達呈增高趨勢。

13、
　　 3.大鼠液壓沖擊傷P-p38MAPK表達與AQP4,AQP4mRNA表達呈正相關。
　　 4.液壓沖擊傷后調控p38MAPK通路可能是治療腦水腫的一種新思路。
　　 第二部分:p38MAPK特異性抑制劑SB203580對大鼠中度液壓沖擊傷性腦水腫AQP4表達變化的影響
　　 目的:觀察p38MAPK特異性抑制劑SB203580對液壓沖擊傷水腫腦組織AQP4表達變化的影響。
　　 方法:雄性

14、SD大鼠152只,體重250～300g,隨機分為4組:NC組、單純損傷組(TBⅠ組)、SBⅠ組和SBⅡ組。后三組再根據傷后1h,6h,12h,24h,3d,7d六個時間點分為6個亞組,每個亞組8只大鼠。SBI組和SBⅡ組分別于術后制作模型前30分鐘,在立體定向儀介導下向右側腦室內注入SB20358010μl,濃度分別為100μmol/L和10μmmol/L。
　　 NC組不進行液壓打擊,僅開顱取腦;TBⅠ組、SBⅠ組和SBⅡ組進

15、行液壓沖擊損傷,并分別于術后第1h、6h、12h、24h、3d和7d于各對應時間點行神經功能學評分,再均以10%水合氯醛過度麻醉,斷頭處死,開顱取腦,經損傷區(qū)切成3mm厚冠狀腦片,HE染色行組織形學觀察,免疫組織化學染色方法檢測AQP4、p38MAPK和p-p38MAPK。從損傷區(qū)前緣取100mg左右腦組織應用干濕重法測腦組織含水量。損傷區(qū)后緣腦組織矢狀分為2部分,其中一份用Western Blot檢測AQP4,p38MAPK和p-p3

16、8MAPK含量。另一份用RT-PCR檢測AQP4mRNA的表達。
　　 結果:
　　 1.神經功能評分
　　 與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組神經功能評分各時間點均有所增加,差異有統計學意義(P＜0.05)。SBⅠ組和SBⅡ組組間比較,僅于12h(4.875±0.835,5.125±0.835)、24h(2.500±0.926,2.75±0.707)、3d(6.125±0.99,6.38±0.744)差別有統計

17、學意義(P＜0.05)。與NC組相比,TBⅠ組,SBⅠ組和SBⅡ組除7天(9.000±0.00,8.375±0.744,8.500±0.535,8.625±0.518)外差異有統計學意義(P＜0.05)。
　　 2.組織學觀察
　　 SBⅠ組和SBⅡ組各個時間點與TBⅠ組比較,腦組織水腫程度有所減輕,范圍有所減小,炎細胞滲出減少,膠質細胞增生減弱,神經元周圍間隙縮小。SBⅡ組各時間點神經細胞水腫均輕于SBⅠ組。
　

18、　 3.大鼠腦含水量
　　 與TBⅠ組各對應時間點相比較,SBⅠ組和SBⅡ組1h均稍低于TBⅠ組(P＞0.05);6h時明顯低于TBⅠ組,差異有統計學意義(P＜0.05),SBⅠ組和SBⅡ組間無差別(P＞0.05),12h時三組間比較均有差異(P＜0.05),腦水含量分別為(81.89±0.58,80.77±0.79,79.48±0.76),24h時腦水含量均達最高,且三組間比較均有差異(P＜0.05),腦水含量分別為(83.

19、31±1.11,82.12±0.90,80.92±0.94),3d開始下降,三組間比較同樣有差異(82.13±0.59,81.12±0.93,79.94±0.99,P＜0.05),7d時明顯降低(81.24±1.01,80.35±0.58,78.94±0.67),SBⅠ組、SBⅡ組仍稍高于TBⅠ組,差異有統計學意義(P＜0.05),但SBⅠ組與SBⅡ組組間比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。
　　 4.免疫組化
　　

20、 與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組AQe4蛋白表達在1h差異均無統計學意義(P＞0.05),余各時間點均低于TBⅠ組,以12h(0.535±0.027,0.489±0.333,0.583±0.016)、24h(0.856±0.023,0.800±0.038,0.909±0.052)、3d(0.776±+0.025,0.708±0.018,0.804±0.016)最為明顯(P＜0.05)。SBⅠ組和SBⅡ組兩組間比較于12h、24h、3

21、d差別有統計學意義(P＜0.05)。
　　 各組P-p38MAPK表達變化趨勢與AQP4變化趨勢相似,傷后6h開始增高,24h達到高峰,隨后逐漸降低。但與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組P-p38MAPK表達于6h(0.265±0.024,0.261±0.020,0.292±0.022)、12h(0.426±0.028,0.350±0.026,0.499±0.019)、24h(0.747±0.044,0.665±0.026,0.

22、911±0.049)、3d(0.580±0.042,0.483±0.039,0.666±0.037)、7d(0.342±0.021,0.256±0.018,0.378±0.026)均低于TBⅠ組,且差別有統計學意義(P＜0.05)。SBⅠ組和SBⅡ組兩組間比較,僅于12h、24h、3d差別有統計學意義(P＜0.05)。
　　 與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組p38MAPK表達除1h外,余各時間點均低于TBⅠ組(P＜0.05)。

23、SBⅠ組和SBⅡ組組間相比,SBⅡ組與SBⅠ組除1h差異無統計學意義(P＞0.05)外,在其余各時間點SBⅡ組p38MAPK表達都低于SBⅠ組(P＜0.05)。
　　 5. Western Blot
　　 與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組AQP4蛋白表達1h差別無統計學意義(P＞0.05),其他時間點差別均有統計學意義(P＜0.05),但SBⅠ組與SBⅡ組間組間比較,于12h、24h、3d差別均有統計學意義(P＜0.0

24、5)。P-p38MAPK表達與AQP4表達一致。
　　 p38MAPK表達1h三組間無差異,TBⅠ組與SBⅠ組比較6h差異無統計學意義(P＞0.05),但TBⅠ組與SBⅡ組、SBⅡ組與SBⅠ組比較差別有統計學意義(P＜0.05),其余各時間點三組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。
　　 6. RT-PCR
　　 與TBⅠ組相比,SBⅠ組、SBⅡ組AQP41h差異無統計學意義(P＞0.05),7d時SBⅡ組與T