染料木素抑制輪狀病毒的復(fù)制及其上調(diào)AQP4表達(dá)機(jī)制研究.pdf

1、[目的]：
　　1.構(gòu)建Wa株及SA-11輪狀病毒(rotavirus，RV)株感染的Caco-2細(xì)胞模型，檢測RV感染的Caco-2細(xì)胞胞膜上4種AQPs的mRNA和蛋白的整體表達(dá)變化，分析AQPs的表達(dá)與RV感染的相關(guān)性。
　　2.檢測染料木素體外抗RV感染的總體活性及其對病毒mRNA和結(jié)構(gòu)蛋白VP-6的表達(dá)影響。
　　3.探討染料木素對RV感染的宿主Caco-2細(xì)胞內(nèi)AQPs表達(dá)的影響及其調(diào)控AQPs的作用機(jī)制。

2、
　　[方法]：
　　1.分別采用qRT-PCR及western-blot的方法檢測Wa株和SA-11兩株RV病毒株感染宿主Caco-2細(xì)胞后4種水通道蛋白AQP1，AQP3，AQP4和AQP8的mRNA和蛋白水平的整體表達(dá)變化。
　　2.采用CCK-8的方法檢測染料木素對Caco-2細(xì)胞的藥物毒性;病毒滴度測定法檢測染料木素抗RV的吸附作用、抗RV的進(jìn)入細(xì)胞作用和抗RV在宿主內(nèi)的復(fù)制作用;ELISA檢測染料木素干預(yù)R

3、V感染的Caco-2細(xì)胞后對胞內(nèi)外的RV抗原分泌的影響;IFA法檢測染料木素干預(yù)RV感染的Caco-2細(xì)胞后RV病毒顆粒釋放的影響;qRT-PCR、western-blot分別檢測染料木素干預(yù)RV感染的Caco-2細(xì)胞后RVmRNA和結(jié)構(gòu)蛋白VP-6的表達(dá)影響。
　　3.檢測染料木素干預(yù)RV感染細(xì)胞后胞內(nèi)的AQPs的表達(dá)變化以及其對AC和PKA的活性影響;Western-blot檢測染料木素干預(yù)RV感染的Caco-2細(xì)胞后對胞內(nèi)C

4、REB，p-CREB及下游AQPs蛋白的表達(dá)變化。
　　[結(jié)果]：
　　1.RV-Wa株感染宿主Caco-2細(xì)胞12h后，AQP1的mRNA的表達(dá)水平與正常對照組相比出現(xiàn)明顯下調(diào)(P＜0.05)，但其蛋白表達(dá)水平?jīng)]有出現(xiàn)明顯的變化(P＞0.05)。AQP4的mRNA和蛋白水平較對照組相比均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），AQP3和AQP8的mRNA和蛋白表達(dá)水平較正常對照組比沒有明顯的表達(dá)差異（P＞0.05)。RV-SA-11

5、株感染Caco-2宿主細(xì)胞12h后，AQP1和AQP4mRNA和蛋白水平較對照組相比出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），AQP3在mRNA水平上與對照組相比出現(xiàn)明顯上調(diào)(P＜0.05)，在蛋白水平上不存在著明顯差異（P＞0.05）。AQP8的mRNA和蛋白表達(dá)水平較正常組對比均沒有明顯的變化(P＞0.05)。
　　2.病毒滴度測定的結(jié)果提示染料木素?zé)o抗RV吸附和入侵細(xì)胞的作用，但是其能有效的抑制RV在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制擴(kuò)增，并且呈現(xiàn)出一定

6、的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)qRT-PCR及Western blot的結(jié)果提示染料木素能有效地抑制RVmRNA轉(zhuǎn)錄和病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP-6的合成。ELISA結(jié)果提示20μM劑量以上的染料木素能抑制胞內(nèi)外RV抗原的釋放。IFA的結(jié)果也表明了染料木素能抑制胞內(nèi)RV病毒顆粒的釋放。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)染料木素能上調(diào)在RV感染過程中低表達(dá)的AQP4，并且該效應(yīng)也呈現(xiàn)出了一定的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。
　　3.染料木素能刺激RV感染后的Ca

7、co-2細(xì)胞使得胞內(nèi)AC活性較對照組相比增加1.38倍，PKA的活性較對照組相比增加了1.59倍;同時(shí)染料木素能促使RV感染的Caco-2細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白發(fā)生磷酸化，磷酸化后的CREB進(jìn)一步促使胞內(nèi)AQP4表達(dá)上調(diào)。
　　[結(jié)論]：
　　1.RV-Wa及SA-11病毒株感染Caco-2細(xì)胞均可下調(diào)胞內(nèi)AQP4的表達(dá)。隨著RV感染時(shí)間的增加，AQP4的表達(dá)水平逐漸下調(diào)。因此我們推測AQP4可為RV感染的作用靶點(diǎn)之一。

8、　　2.染料木素?zé)o抗RV吸附和入侵細(xì)胞的作用，但是能有效地抑制輪狀病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和RV結(jié)構(gòu)蛋白VP-6的合成，從而抑制RV的在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。同時(shí)染料木素在抑制病毒復(fù)制的過程中上調(diào)了RV感染過程中低表達(dá)的AQP4。
　　3.染料木素可通過調(diào)控cAMP/PKA/CREB信號通路上調(diào)RV感染Caco-2細(xì)胞胞內(nèi)AQP4的表達(dá)。
　　4.染料木素抗RV的作用是通過其抑制病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯和上調(diào)宿主細(xì)胞的AQP4的表達(dá)所調(diào)控的