染料木素抑制輪狀病毒的復制及其上調AQP4表達機制研究.pdf

1、[目的]：
　　1.構建Wa株及SA-11輪狀病毒(rotavirus，RV)株感染的Caco-2細胞模型，檢測RV感染的Caco-2細胞胞膜上4種AQPs的mRNA和蛋白的整體表達變化，分析AQPs的表達與RV感染的相關性。
　　2.檢測染料木素體外抗RV感染的總體活性及其對病毒mRNA和結構蛋白VP-6的表達影響。
　　3.探討染料木素對RV感染的宿主Caco-2細胞內AQPs表達的影響及其調控AQPs的作用機制。

2、
　　[方法]：
　　1.分別采用qRT-PCR及western-blot的方法檢測Wa株和SA-11兩株RV病毒株感染宿主Caco-2細胞后4種水通道蛋白AQP1，AQP3，AQP4和AQP8的mRNA和蛋白水平的整體表達變化。
　　2.采用CCK-8的方法檢測染料木素對Caco-2細胞的藥物毒性;病毒滴度測定法檢測染料木素抗RV的吸附作用、抗RV的進入細胞作用和抗RV在宿主內的復制作用;ELISA檢測染料木素干預R

3、V感染的Caco-2細胞后對胞內外的RV抗原分泌的影響;IFA法檢測染料木素干預RV感染的Caco-2細胞后RV病毒顆粒釋放的影響;qRT-PCR、western-blot分別檢測染料木素干預RV感染的Caco-2細胞后RVmRNA和結構蛋白VP-6的表達影響。
　　3.檢測染料木素干預RV感染細胞后胞內的AQPs的表達變化以及其對AC和PKA的活性影響;Western-blot檢測染料木素干預RV感染的Caco-2細胞后對胞內C

4、REB，p-CREB及下游AQPs蛋白的表達變化。
　　[結果]：
　　1.RV-Wa株感染宿主Caco-2細胞12h后，AQP1的mRNA的表達水平與正常對照組相比出現(xiàn)明顯下調(P＜0.05)，但其蛋白表達水平沒有出現(xiàn)明顯的變化(P＞0.05)。AQP4的mRNA和蛋白水平較對照組相比均出現(xiàn)表達下調（P＜0.01），AQP3和AQP8的mRNA和蛋白表達水平較正常對照組比沒有明顯的表達差異（P＞0.05)。RV-SA-11

5、株感染Caco-2宿主細胞12h后，AQP1和AQP4mRNA和蛋白水平較對照組相比出現(xiàn)表達下調（P＜0.05），AQP3在mRNA水平上與對照組相比出現(xiàn)明顯上調(P＜0.05)，在蛋白水平上不存在著明顯差異（P＞0.05）。AQP8的mRNA和蛋白表達水平較正常組對比均沒有明顯的變化(P＞0.05)。
　　2.病毒滴度測定的結果提示染料木素無抗RV吸附和入侵細胞的作用，但是其能有效的抑制RV在宿主細胞內的復制擴增，并且呈現(xiàn)出一定

6、的劑量-效應和時間-效應關系。同時qRT-PCR及Western blot的結果提示染料木素能有效地抑制RVmRNA轉錄和病毒結構蛋白VP-6的合成。ELISA結果提示20μM劑量以上的染料木素能抑制胞內外RV抗原的釋放。IFA的結果也表明了染料木素能抑制胞內RV病毒顆粒的釋放。同時我們發(fā)現(xiàn)染料木素能上調在RV感染過程中低表達的AQP4，并且該效應也呈現(xiàn)出了一定的劑量-效應和時間-效應關系。
　　3.染料木素能刺激RV感染后的Ca

7、co-2細胞使得胞內AC活性較對照組相比增加1.38倍，PKA的活性較對照組相比增加了1.59倍;同時染料木素能促使RV感染的Caco-2細胞內CREB蛋白發(fā)生磷酸化，磷酸化后的CREB進一步促使胞內AQP4表達上調。
　　[結論]：
　　1.RV-Wa及SA-11病毒株感染Caco-2細胞均可下調胞內AQP4的表達。隨著RV感染時間的增加，AQP4的表達水平逐漸下調。因此我們推測AQP4可為RV感染的作用靶點之一。

8、　　2.染料木素無抗RV吸附和入侵細胞的作用，但是能有效地抑制輪狀病毒RNA的轉錄和RV結構蛋白VP-6的合成，從而抑制RV的在宿主細胞內的復制。同時染料木素在抑制病毒復制的過程中上調了RV感染過程中低表達的AQP4。
　　3.染料木素可通過調控cAMP/PKA/CREB信號通路上調RV感染Caco-2細胞胞內AQP4的表達。
　　4.染料木素抗RV的作用是通過其抑制病毒蛋白的轉錄、翻譯和上調宿主細胞的AQP4的表達所調控的