PPARγ在結(jié)締組織病相關(guān)的肺間質(zhì)病變中抗纖維化作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 結(jié)締組織病(connective tissue disease，CTD)累及肺部的病變多種多樣，表現(xiàn)為氣道、肺間質(zhì)、肺實(shí)質(zhì)、血管系統(tǒng)及胸膜等部位病變，其中間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease， ILD)是CTD累及肺部的主要并發(fā)癥，又稱彌漫性實(shí)質(zhì)性肺疾病，具有相似的影像學(xué)、病理學(xué)及臨床表現(xiàn)的肺功能紊亂性疾病。有文獻(xiàn)報(bào)道CTD患者ILD發(fā)病率達(dá)25％，而10年生存率僅為60％，雖然不同

2、文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)病率及病死率不同，但總體差異不大。CTD-ILD的治療目前多使用激素及免疫抑制劑治療，但總體治療效果不佳且藥物不良反應(yīng)限制其長(zhǎng)期應(yīng)用。因此迫切需要我們深入了解CTD-ILD發(fā)病機(jī)制，以便尋求確切有效的治療方法。
　　 ILD主要病理變化是肺泡慢性炎癥、間質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。在纖維變性過(guò)程中存在大量促炎和促纖維化細(xì)胞因子參與，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factorβ1，TG

3、Fβ1)能介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的趨化、增殖及分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、聚集及減少細(xì)胞外基質(zhì)降解等效應(yīng)，被認(rèn)為是肺纖維化過(guò)程最關(guān)鍵細(xì)胞因子。而且我們前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)CTD-ILD患者肺組織中TGFβ1的表達(dá)增加，因此阻斷TGFβ1效應(yīng)可能改善組織纖維化程度，達(dá)到抗纖維化效應(yīng)。近年來(lái)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptor gamma，PPARγ)的配體

4、能通過(guò)干擾TGFβ1效應(yīng)改善肺纖維化程度，但PPARγ干擾TGFβ1效應(yīng)的具體機(jī)制仍不明確，可能是通過(guò)影響Smad復(fù)合物核內(nèi)聚集、Smad2/3蛋白的蛋白后修飾及競(jìng)爭(zhēng)輔活化因子或轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與靶基因的結(jié)合，達(dá)到干擾TGFβ1促纖維化效應(yīng)。本研究擬通過(guò)了解PPARγ配體羅格列酮對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的影響，觀察α-SMA蛋白，Ⅰ型膠原和CTGF mRNA，乙?；疭md3變化，初步探討羅格列酮抗肺纖維化作用及可能機(jī)制。
　　

5、研究目的：
　　 1.通過(guò)收集CT引導(dǎo)下肺穿刺病人的標(biāo)本，了解PPARγ在CTD-ILD患者肺組織的表達(dá)水平。
　　 2.原代培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)了解TGFβ1對(duì)人肺成纖維細(xì)胞分化的影響及PPARγ配體羅格列酮對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)細(xì)胞分化是否存在抑制效應(yīng)。
　　 3.通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討PPARγ配體對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)細(xì)胞分化影響的機(jī)制是否是通過(guò)與Smad3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P300實(shí)現(xiàn)的。
　　 研究意義：<

6、br>　　 通過(guò)以上研究，探討是否由于CTD-ILD患者肺組織中PPARγ表達(dá)降低，導(dǎo)致肺纖維化發(fā)生發(fā)展，了解PPARγ配體羅格列酮是否能通過(guò)干擾TGFβ1效應(yīng)實(shí)現(xiàn)抗纖維化作用，這種干擾效應(yīng)是否是通過(guò)與Smad3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P300，進(jìn)而影響Smad3乙酰化，從而為CTD-ILD的基礎(chǔ)研究提供一些理論依據(jù)，為CTD-ILD的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 資料與方法：
　　 1.1研究對(duì)象與納入標(biāo)準(zhǔn)
　　 收集2001-

7、2010年在廣東省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的CTD-ILD行CT引導(dǎo)下細(xì)針穿刺肺活檢術(shù)患者37例，女性29例，男性8例，平均年齡47.36±2.24歲，其中SSc6例，SLE5例，pSS5例，PM/DM10例，RA3例，血管炎4例，MCTD4例。選取20例不吸煙并無(wú)感染的肺癌患者遠(yuǎn)離癌旁的正常肺組織作為對(duì)照組，其中女性12例，男性8例，平均年齡45.62±1.12歲。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組年齡及性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 CTD-ILD

8、納入標(biāo)準(zhǔn):至少符合以下條件的中的①+⑤。①符合各類結(jié)締組織病國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)的診斷標(biāo)準(zhǔn);②有咳嗽、咳痰、胸悶、胸痛及氣促等呼吸道表現(xiàn)，排除阻塞性通氣障礙者;③肺功能:限制性通氣功能障礙、氣體彌散功能降低;④影像學(xué)改變:高分辨率CT(HRCT)檢查顯示磨玻璃樣、網(wǎng)格樣、蜂窩樣、纖維條索狀影及囊性變等;⑤肺活檢病理表現(xiàn):符合2002年美國(guó)胸科學(xué)會(huì)與歐洲呼吸學(xué)會(huì)(ATS/ERS)制訂病理表現(xiàn)，并排除妊娠、感染、藥物、腫瘤及吸煙等因素。
　　

9、 該研究得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)，且取得所有參與者的知情同意。
　　 1.2實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.2.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺組織中PPARγ表達(dá):37例CTD-ILD和20例對(duì)照組肺組織，石蠟包埋肺組織，免疫組織化學(xué)染色。脫蠟至水后，用3％雙氧水作用15min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，1％Triton X-100透化細(xì)胞膜10 min，兔抗人PPARγ單克隆抗體(CST1∶200)，室溫孵育60min，辣根酶標(biāo)記抗兔二抗（

10、基因公司）室溫孵育30min，二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。隨機(jī)選取5個(gè)*400視野，用IPP軟件，準(zhǔn)確選取陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域，并計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)面積占該視野下肺組織的面積比。
　　 1.2.2細(xì)胞培養(yǎng):選取年齡＜55歲、無(wú)感染、不吸煙患者癌旁正常肺組織，用組織塊法行人肺成纖維細(xì)胞（primary human lung fibroblast，HLF）的原代培養(yǎng)。肺成纖維細(xì)胞置于37℃5％

11、 CO2培養(yǎng)箱，用達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)[4.5g/L葡萄糖、10％胎牛血清(FBS)、0.01％青霉素/鏈霉素及含谷氨酰胺]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)波形蛋白以確定肺成纖維細(xì)胞類型。第4～10代肺成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　 1.2.3四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活性:以每孔5×104個(gè)細(xì)胞鋪于96孔板，細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入TGFβ1和羅格列酮實(shí)驗(yàn)濃度(1、5、10、20及40μmol/L)于孔板，并設(shè)置空白對(duì)照，3

12、7℃、體積分?jǐn)?shù)為5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，加20ul MTT(5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加200ul二甲基亞砜(DMSO)終止培養(yǎng)，37℃孵育30min，測(cè)560nm處吸光度（A）值。
　　 1.2.4蛋白印跡法(Westem-blotting)檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞中α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá):①肺成纖維細(xì)胞按105～106個(gè)/孔鋪六孔板，加入不同濃度的TGFβ1（0、1.25、2.5、5、7.5ng/ml）培養(yǎng)4

13、8小時(shí)后提取全蛋白，檢測(cè)α-SMA②肺成纖維細(xì)胞按105～106個(gè)/孔鋪六孔板，無(wú)血清培養(yǎng)12h后，更換含10％血清DMEM培養(yǎng)基，在加入TGFβ1(5ng/ml)之前2h加入不同濃度羅格列酮，分為T(mén)GFβ1(5ng/ml)組及TGFβ1（5ng/ml）+羅格列酮（1、5、10、20和40μmol/L）組，繼續(xù)培養(yǎng)48h，提取全細(xì)胞蛋白。③肺成纖維細(xì)胞按105～106個(gè)/孔鋪六孔板，無(wú)血清培養(yǎng)12h后，更換10％血清DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)

14、胞分為:空白組、TGFβ1(5ng/ml)組、TGFβ1(5ng/ml)+羅格列酮(20μmol/L)組及TGFβ1(5ng/ml)+羅格列酮(20μmol/L)組+GW9662(10μmol/L)組，培養(yǎng)48h，提取全細(xì)胞蛋白。用BCA(bicinchoninic acid)法測(cè)定蛋白濃度。等量(10～15ug)上樣，5％～10％聚丙烯酰胺凝膠（碧云天公司），電泳分離、電轉(zhuǎn)及脫脂奶粉封閉后，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)4℃分別孵育一抗α

15、-SMA（1∶400博士德），羊抗兔IgG二抗(1∶2000)4℃孵育1h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影、曝光。以甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。用Image J軟件測(cè)灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR:檢索NCBI網(wǎng)站GenBank查詢?nèi)刷裥湍z原、CTGF、GAPDH的mRNA序列，引物由捷瑞生物科技公司設(shè)計(jì)與合成。GAPDH序列:上游引物5'-GCTGATGATCTTGAGGCT

16、GTTGTC-3'下游引物5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'; CTGF序列:上游引物5'-TCGGGAAGGGGCAGTCAGGGCT-3'下游引物5'-CCAACCGCAAGATCGGCGTGTG-3';Ⅰ型膠原序列:上游引物5'-CTTGGTCGGTGGGTGACTCTG-3'下游引物5'-GGCAAGGTGTTGTGCGATGAC-3'。人肺成纖維細(xì)胞按106個(gè)/ml鋪板，無(wú)血清培養(yǎng)12小時(shí)后加藥，在加入TG

17、Fβ1(5ng/ml)前2小時(shí)加入不同濃度的羅格列酮(1-40μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48h， Trizol reagent（Invitrogen，USA）法抽提總RNA。分別用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒和SYBRTM Premix ExTaqTMⅡ試劑盒(TakaRa,寶生物工程(大連)有限公司）將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。數(shù)據(jù)處理:mRNA表達(dá)的計(jì)算以2

18、-△△CT，△CT=CT（實(shí)驗(yàn)組-對(duì)照組）。
　　 1.2.6免疫共沉淀-免疫印跡法檢測(cè)乙?；疭mad3表達(dá)及Smad3或PPARγ與P300結(jié)合情況:肺成纖維細(xì)胞按106～107個(gè)/瓶培養(yǎng)，按下列條件處理:(1)成纖維細(xì)胞中加入TGFβ1(5ng/ml)誘導(dǎo)60、90、180min后收獲細(xì)胞提取全蛋白，免疫共沉淀檢測(cè)乙?；疭mad3變化;(2)在成纖維細(xì)胞中加入TGFβ1(5ng/ml)和（或）羅格列酮(20μmol/L)，分

19、為空白組、TGFβ1(5ng/ml)組、羅格列酮（20μmol/L）組及TGFβ1+羅格列酮組培養(yǎng)90min后，提取全蛋白裂解液檢測(cè)Smad3與PPARγ結(jié)合P300情況。在(1)(2)條件下處理提取的全細(xì)胞蛋白中分別加入預(yù)沉淀抗體Smad3（1∶100 CST公司）、P300（1∶100 Invitrogen公司）4℃1h，加入洗滌后Protein G/A agarose（15ul/lug抗體）4℃孵育90min后，4℃14000g6

20、 s離心棄上清，細(xì)胞裂解液（不含蛋白酶抑制劑）4℃14000g6秒洗滌混合物3次，棄上清余沉淀約20ul加蛋白變性劑沸水煮5min，-20℃保存行蛋白印跡，5％～10％聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離、電轉(zhuǎn)及脫脂奶粉封閉后，PVDF膜4℃分別孵育一抗Acetylate-Lysine（1∶1000 CST公司）;PPARγ（1∶1000 CST公司）及Smad3（1∶1000 CST公司），羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶2000)4℃孵育1h，增強(qiáng)化

21、學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影、曝光。以GAPDH為內(nèi)參，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。用Image J軟件測(cè)灰度值，統(tǒng)計(jì)分析。
　　 1.3統(tǒng)計(jì)方法
　　 數(shù)據(jù)處理使用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用x±s表示，多組資料比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步的兩兩比較，采用LSD檢驗(yàn);非正態(tài)分布的資料用[M(QL～QU)]表示，多組資料比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)及Mann-Whitne

22、y分析;計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)p=0.05
　　 研究結(jié)果：
　　 2.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CTD-ILD患者肺組織中PPARγ的表達(dá)降低
　　 對(duì)照組肺組織中PPARγ主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等中，且主要在胞核中表達(dá)。PPARγ陽(yáng)性表達(dá)面積百分比在CTD-ILD患者肺組織中明顯低于對(duì)照組[0.92％(1.44％)，3.50％(1.94％)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-8.92，P＜

23、0.01)。
　　 2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性未受影響
　　 肺成纖維細(xì)胞暴露于TGFβ1和不同濃度羅格列酮（1、5、10、20及40μmol/L）72h后，A值分別為（0.35±0.21，0.34±0.34，0.27±0.17，0.19±0.07，0.33±0.36），空白對(duì)照組為0.23±0.09，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明加入藥物后細(xì)胞活性不受影響。
　　 2.3TGFβ1促進(jìn)人肺成纖維

24、細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化
　　 與空白組相比，肺成纖維細(xì)胞經(jīng)不同濃度的TGFβ1(0、1.25、2.5、5及7.5ng/ml)誘導(dǎo)48h后，發(fā)現(xiàn)隨著TGFβ1濃度增加，α-SMA相對(duì)表達(dá)量增加，且具有濃度依賴效應(yīng)，在TGFβ1濃度5ng/ml時(shí)達(dá)最佳刺激效應(yīng)。α-SMA表達(dá)量變化在TGFβ11.25ng/ml組與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，在其余TGFβ1組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)

25、。
　　 2.4 PPARγ配體能夠顯著抑制TGFβ1誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞分化。
　　 羅格列酮（1、5、10、20及40μmol/L）干預(yù)后與對(duì)照組羅格列酮0μmol/L相比α-SMA相對(duì)表達(dá)量下降，羅格列酮1μmol/L組與對(duì)照組羅格列酮0μmol/L組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而羅格列酮濃度為(5、10、20及40μmol/L)與對(duì)照組羅格列酮0μmol/L組相比，α-SMA表達(dá)量變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

26、(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01)。
　　 2.5羅格列酮抑制TGFβ1誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞分化的效應(yīng)依賴于PPARγ
　　 在人肺成纖維細(xì)胞中羅格列酮（20μmol/L）能抑制TGFβ1(5ng/ml)誘導(dǎo)成α-SMA表達(dá)，但當(dāng)加入PPARγ拮抗劑GW9662（10μmol/L）時(shí)，α-SMA相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)， GW9662能夠大部分抵消羅格列酮的這種抑制效應(yīng)。在TGFβ1（5ng/ml）+羅格列酮

27、（20μmol/L）組與TGFβ1(5ng/ml)組相比，α-SMA表達(dá)量相對(duì)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而TGFβ1+羅格列酮+GW9662與TGFβ1(5ng/ml)+羅格列酮(20μmol/L)組相比，α-SMA表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.6 PPARγ配體抑制TGFβ1誘導(dǎo)Ⅰ型膠原、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)mRNA表達(dá):
　　 羅格列酮（1、5、10、20及40μmo

28、l/L）干預(yù)后與對(duì)照組羅格列酮0μmol/L相比Ⅰ型膠原、CTGF-mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，羅格列酮（1、5、10、20及40μmol/L）組與對(duì)照組羅格列酮0μmol/L組相比較，Ⅰ型膠原表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而羅格列酮濃度為（1、5、10、20及40μmol/L）與對(duì)照組羅格列酮0μmol/L組相比，CTGF-mRNA表達(dá)量變化差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.7 TGFβ1增加肺成纖維細(xì)

29、胞Smad3乙?；?br>　　 在人肺成纖維細(xì)胞中加TGFβ1(5ng/ml)，在不同時(shí)間段用免疫共沉淀-免疫印跡法(IP-WB)檢測(cè)乙酰化Smad3表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)肺成纖維細(xì)胞經(jīng)TGFβ1誘導(dǎo)60、90及180min后與對(duì)照組相比，乙?；疭mad3表達(dá)增加，且在90min處達(dá)高峰，與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.8羅格列酮通過(guò)干擾smad3與P300結(jié)合，來(lái)發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)。
　　 肺成纖

30、維細(xì)胞在TGFβ1和（或）羅格列酮誘導(dǎo)下培養(yǎng)90min，TGFβ1組與空白對(duì)照組相比Smad3與P300結(jié)合相對(duì)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，羅格列酮+TGFβ1組與TGFβ1組相比Smad3與P300結(jié)合相對(duì)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而PPARγ與P300結(jié)合相對(duì)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 討論：
　　 CTD-ILD臨床發(fā)病率和死亡率較高，且缺乏有效的治療方法，因此間質(zhì)性肺

31、疾病越來(lái)越引起人們重視。研究發(fā)現(xiàn)PPARγ具有多種生物學(xué)效應(yīng)，不僅能促進(jìn)脂肪及脂蛋白代謝，調(diào)節(jié)機(jī)體穩(wěn)態(tài)，還具有抑制炎癥反應(yīng)及抗纖維化等作用。PPARγ發(fā)揮作用需要配體激活，因此，我們加入外源性噻唑烷二酮類的人工配體羅格列酮，了解PPARγ在CTD-ILD患者肺組織中抗纖維化作用及可能機(jī)制，以期尋求新的治療策略。
　　 我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CTD-ILD患者肺組織中PPARγ蛋白表達(dá)明顯降低，并且PPARγ主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、成纖維

32、細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中，這些細(xì)胞是肺組織內(nèi)主要細(xì)胞成分，主要參與氣體交換、組織損傷與修復(fù)及炎癥反應(yīng)等功能。其中巨噬細(xì)胞可以合成并釋放溶酶體酶和致纖維化因子，刺激纖維細(xì)胞增生和膠原合成;上皮細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞增生和膠原合成有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也可以穿越基底膜到達(dá)纖維化病灶，經(jīng)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)PPARγ能夠誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡并抑制肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制單核細(xì)胞趨化蛋白1、白細(xì)胞介素-8及抑制單核細(xì)

33、胞聚集，減輕炎癥反應(yīng)?；罨腜PARγ還能夠抑制成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。因此PPARγ表達(dá)下降在一定程度上加速肺纖維化發(fā)展，那么如果能夠提高PPARγ活性，則很有可能減緩肺纖維化過(guò)程的發(fā)生發(fā)展。
　　 我們前期研究發(fā)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)的TGFβ1在CTD-ILD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都起到重要作用，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PPARγ的配體能抑制TGFβ誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞（Ⅰ型和Ⅲ膠原的主要分泌細(xì)胞）轉(zhuǎn)化，

34、MTT法證實(shí)此效應(yīng)并非PPARγ配體本身毒性所致。與我們研究相似， Milam等和Genovese等發(fā)現(xiàn)PPARγ配體羅格列酮能抑制TGFβ1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化，改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷及纖維化。但目前關(guān)于PPARγ配體抑制TGFβ1促纖維化效應(yīng)的具體機(jī)制尚不明確。
　　 我們還發(fā)現(xiàn)，PPARγ配體還能夠顯著抑制TGFβ1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞COL1A1、CTGF mRNA表達(dá)。其中COL1A1 mRNA編碼Ⅰ型膠原蛋白

35、，Ⅰ型膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其過(guò)度分泌沉積導(dǎo)致肺瘢痕組織形成，促使纖維化發(fā)生。而CTGF是CNN家族成員，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生及組織肉芽組織形成及不同類型的細(xì)胞粘附聚集和膠原收縮。而有研究發(fā)現(xiàn)在CTGF存在條件下， TGFβ1在極低濃度時(shí)也能與其受體結(jié)合，說(shuō)明CTGF能加強(qiáng)TGFβ1與其受體結(jié)合，引起TGFβ1/Smad通路介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄活化，促使纖維化發(fā)生。因此PPARγ配體抑制TGFβ1促纖維化效應(yīng)可能

36、部分是通過(guò)抑制CTGF基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　 TGFβ1/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，需要TGFβ1受體激活的Smad2/3形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核結(jié)合活化因子結(jié)合CBP/P300，再與靶基因SBE序列，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。人肺成纖維細(xì)胞中Smad3促進(jìn)TGFβ1誘導(dǎo)膠原收縮，且在TGFβ1誘導(dǎo)基因表達(dá)中起重要作用。且有研究發(fā)現(xiàn)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，敲除Smad3基因可緩解肺纖維化程度，說(shuō)明Smad3在TGFβ1/S

37、mad信號(hào)通路中起重要作用。Smad3蛋白可以在通路中發(fā)生磷酸化、乙?；胺核鼗鹊鞍仔揎?，那么PPARγ配體抑制TGFβ1通路效應(yīng)可能與Smad3蛋白有密切關(guān)系。肺成纖維細(xì)胞系(A549)中PPARγ配體羅格列酮對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的Smad2/3的磷酸化水平變化沒(méi)有影響。而我們發(fā)現(xiàn)肺成纖維細(xì)胞中加入TGFβ1后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)乙?；疭mad3蛋白表達(dá)增加。而蛋白的乙?；c基因的活躍表達(dá)有關(guān)，蛋白發(fā)生乙?；?，發(fā)生染色質(zhì)構(gòu)型重建，染色質(zhì)處于

38、相對(duì)松弛狀態(tài)，使蛋白易于與活化因子或其他蛋白相互作用，利于靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。蛋白乙?；?去乙酰化修飾是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制之一，而這種修飾作用分別由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)調(diào)控，所以HAT/HDAC間接調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和沉默，而HAT/HDAC平衡的紊亂會(huì)使基因表達(dá)失控，導(dǎo)致組織纖維化發(fā)生。Smad3蛋白乙?；枰狧AT作用，根據(jù)HAT在細(xì)胞內(nèi)分布及誘導(dǎo)乙?；蟮男?yīng)分為A型HAT(核內(nèi))和B型HAT(胞質(zhì)

39、)兩類，其中A型HAT中的p300是TGFβ1/Smad通路調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄所必須的，且TGFβ1/Smad通路與PPARγ通路在細(xì)胞內(nèi)共用活化因子P300，因此可能存在競(jìng)爭(zhēng)抑制。正如腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制TGFβ1誘導(dǎo)膠原產(chǎn)生及α-SMA表達(dá)是通過(guò)與Smad3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P300。而P300是腺病毒EIA相關(guān)的核磷蛋白，具有固定結(jié)構(gòu)，含有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶區(qū)域(HAT)，能使Smad3的MH2區(qū)K378位點(diǎn)發(fā)生乙?；?。且TGFβ

40、1調(diào)節(jié)smad2/3乙?；⒋龠M(jìn)Smad3與P300結(jié)合在其他細(xì)胞系中也有被證實(shí)。本次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，在人肺成纖維細(xì)胞中加入TGFβ1能促使Smad3與P300的結(jié)合增多，而加入PPARγ配體羅格列酮后，Smad3與P300結(jié)合減少。由于PPARγ通路也需要結(jié)合P300，單獨(dú)加入配體后，PPARγ與P300結(jié)合相對(duì)增加，所以PPARγ配體發(fā)揮抗纖維化可能通過(guò)與Smad3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P300，使得Smad3/P300復(fù)合物形成減少有關(guān)，進(jìn)而

41、減少靶基因轉(zhuǎn)錄。在皮膚成纖維細(xì)胞中也存在PPARγ配體通過(guò)作用轉(zhuǎn)錄活化因子P300消弱Smad依賴的膠原合成，使得TGFβ1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)減弱。另外，PPARγ配體抑制效應(yīng)也可能通過(guò)干擾Smad2/3/4復(fù)合物在細(xì)胞核內(nèi)聚集或阻斷Smad復(fù)合物與SBE序列啟動(dòng)子結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄過(guò)程，而這一原因有待證實(shí)。
　　 綜上所述，CTD-ILD患者肺組織中PPARγ的表達(dá)量降低，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPARγ配體能夠顯著抑制TGFβ1誘導(dǎo)的肺成纖維

42、細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這一作用可能是通過(guò)與Smad3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合P300來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，PPARγ配體活化的PPARγ通路有望成為治療結(jié)締組織病相關(guān)的間質(zhì)性肺疾病的新靶點(diǎn)。
　　 結(jié)論：
　　 1.PPARγ在CTD-ILD中表達(dá)降低，不能發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用，間接導(dǎo)致肺纖維化發(fā)生發(fā)展。
　　 2.羅格列酮具有抗纖維化效應(yīng)，且是依賴PPARγ實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.PPRγ抗肺纖維化效應(yīng)機(jī)制之一是通過(guò)與Sm