利用RT-PCR方法進(jìn)行風(fēng)疹及麻疹病毒的臨床檢測(cè)及基因序列分析.pdf

1、風(fēng)疹是一種通過(guò)呼吸道傳染、由風(fēng)疹病毒(RV)引起的急性發(fā)熱出疹性傳染病。雖然具自限性，但常出現(xiàn)流行或爆發(fā)，嚴(yán)重危害青少年的健康。且婦女在妊娠的前三個(gè)月感染RV后易引起胎兒先天性風(fēng)疹綜合征(CRS)，導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)或胎兒畸形等。麻疹是由麻疹病毒(MV)引起的一種以發(fā)熱呼吸道卡他和遍及全身斑丘疹為特征的急性病毒性傳染病，亦是危害兒童生命健康極其嚴(yán)重的傳染病之一。由于典型病例很難見到，從臨床表現(xiàn)上MV與RV難以鑒別。傳統(tǒng)用于RV及MV診斷的方

2、法有病毒的分離培養(yǎng)法、血清IgM抗體檢測(cè)等方法，但由于培養(yǎng)周期長(zhǎng)、手續(xù)復(fù)雜、抗體之間存在交叉、受時(shí)間的限制等不足，常出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，且不能看出病毒基因的變異情況。本研究采用RT-PCR與ELISA抗體檢測(cè)相結(jié)合的方法進(jìn)行病毒篩查，探討RT-PCR方法的優(yōu)勢(shì)，并對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行基因序列及系統(tǒng)發(fā)生樹分析，研究大連地區(qū)RV及MV的基因型及變異情況，同時(shí)得到作為臨床檢測(cè)較好的標(biāo)本類型。 材料和方法：1．收集59例臨床疑似RV及MV患者

3、的血液、尿液和唾液提取總RNA，利用試劑盒及特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及巢式PCR反應(yīng)，以PCR．產(chǎn)物的電泳條帶大小作為判斷陽(yáng)性結(jié)果的依據(jù)(以RV及MV質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照)。2．對(duì)電泳結(jié)果陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化及序列測(cè)定。3．ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)。4．通過(guò)DNAStar軟件對(duì)陽(yáng)性結(jié)果與世界其他地區(qū)的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹分析。 結(jié)果：1.59例標(biāo)本中有3例(5.08﹪)巢式PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果出現(xiàn)約592bp大小的條帶，與

4、RV陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒PCR產(chǎn)物的大小相同，判斷為RV陽(yáng)性。有2例(3.39﹪)巢式PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)約547bp大小的條帶，與MV陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物的大小相同，判斷為MV陽(yáng)性。 2.以E1.3n、E1.4R．為外圍引物對(duì)PCR陽(yáng)性的37<'＃>、41<'＃>、43<'＃>標(biāo)本測(cè)序，基因片斷為592bp， 41<'＃>的突變率為2.74﹪，符合率為97.26﹪；37<'＃>的突變率為2.19﹪，符合率為97.8 1﹪43<'＃>的突

5、變率為2.19﹪，符合率為97.81﹪。以n3、n4R．為外圍引物對(duì)PCR陽(yáng)性的44<'＃>、46<'＃>標(biāo)本測(cè)序，基因片斷為547bp，46<'＃>。的突變率為9.39﹪，符合率為90.61﹪；44<'＃>的突變率為7.27﹪，符合率為92.73﹪。 3.血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果：其中RV IgM抗體陽(yáng)性5例，MV IgM抗體陽(yáng)性8例，MV IgM抗體可疑陽(yáng)性3例。4.RV&MV-PCR．陽(yáng)性結(jié)果中血液為2份，尿液為0份，唾液為3份，一代培養(yǎng)細(xì)

6、胞為2例。RV&MV-ELISA陽(yáng)性結(jié)果中血液為7份，尿液為3份，唾液為6份。 5.有2例為MVRT-PCR陽(yáng)性對(duì)應(yīng)MV IgM抗體陽(yáng)性，2例為RV RT-PCR陽(yáng)性對(duì)應(yīng)MV IgM抗體陽(yáng)性，1例為RV RT-PCR陽(yáng)性而未檢測(cè)到抗體，5例為僅RV IgM抗體陽(yáng)性而未檢測(cè)到抗原，7例為僅MV IgM抗體陽(yáng)性而未檢測(cè)到抗原。 6.系統(tǒng)發(fā)生樹分析：本實(shí)驗(yàn)的3株風(fēng)疹病毒El糖蛋白編碼基因與基因Ⅰ型代表株RA27核苷酸的同源性為96.9﹪～97

7、.5﹪，與中國(guó)1980年分離的風(fēng)疹病毒基因Ⅱ型代表株BRDⅡ的核苷酸同源性為91.8﹪～92.5﹪，其中SXM-37<'＃>群RV和SXM-43<'＃>RV完全相同，與JUDITH關(guān)系最近，同源性為99.2﹪;SXM-41<'＃>RV與RA27-3關(guān)系最近，同源性為99.2﹪。本實(shí)驗(yàn)的SXM-44<'＃>MV與DL6China97n關(guān)系最近，同源性為99.3﹪；而SXM-46<'＃>MV與hebei05-18關(guān)系最近，同源性為99.1﹪

8、。結(jié)論：1.本研究表明出疹早期(2-3天)應(yīng)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，特異性強(qiáng)，若陽(yáng)性則不需檢測(cè)抗體即可確診；若RT-PCR陰性則在出疹2-15天時(shí)檢測(cè)抗體以確診。RT-PCR方法可作為病毒性疾病早期快速診斷的有效方法，ELISA方法則可作為它的有利補(bǔ)充。但RV和MV抗體存在交叉反應(yīng)，若要鑒別二者則需RT-PCR檢測(cè)。 2.RVE1膜蛋白和MV的N基因均較為穩(wěn)定，可以作為RV和MVRT-PCR診斷的代表基因。 3.血液和唾液作為RT-PCR