兔出血癥病毒分離鑒定VP60基因克隆及RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、兔出血癥(Rabbithemorrhagicdisease，RHD)是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的兔的急性高度接觸性傳染病，給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，為了在生產(chǎn)中防制該病，有必要對毒株進行分離鑒定及其特性研究，以及建立一種靈敏、準確的檢測方法。 本研究從兔病料中分離鑒定出了3株有不同血凝性的兔出血癥病毒，分別命名為RHDV-whn-1，2，3，毒株經(jīng)兔體傳至3代后，能引起RHDV抗體為陰性的家兔發(fā)病及死亡呈現(xiàn)穩(wěn)定的規(guī)律性。

2、其中whn-2株血凝效價為1∶640，whn-1，3的血凝效價僅分別為1∶5，1∶10，但瓊擴實驗及對流免疫電泳均能看到清晰的沉淀線，電鏡負染可見大量球形、核心密度不同、大小約30nm的病毒粒子。 根據(jù)GenBank中的RHDV的全基因序列，設(shè)計1對長為29bp的引物，在兩引物的5’端加入EcoRI和XbaI酶切位點，對兔出血癥病毒VP60基因進行RT-PCR擴增，擴增出約1.7kb的衣殼蛋白VP60基因的完整片段，將其插入克隆

3、載體pMD18-T上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-VP60-1，2，3，對重組質(zhì)粒的測序顯示，VP60基因全長1740bp，共編碼579個氨基酸，并在GenBank中注冊(登錄號分別為DQ069280，DQ069281，DQ069282)。 將3株RHDV及世界上其它RHDV，以及RCV，EBHSV的VP60基因序列進行多序列比對，結(jié)果顯示whn-1與whn-2同源性為96.1％，whn-1與whn-3同源性為96.5％，whn-2與w

4、hn-3同源性為99.4％，比對序列中所有RHDV與RCV的同源性為84.7％-86.4％，與EBHSV的同源性為69.0％-70.5％，而RHDV各毒株之間同源性為89.7％-99.4％，表明VP60是一個很保守片段。在遺傳進化上，世界各地的RHDV毒株在核苷酸水平上趨向4個支譜系，在氨基酸水平上趨向3個支譜系，譜系間沒有明顯的地理或時間特征，RHDV-whn-1，2，3株分布在2個不同的譜系中，與RHDV為同一屬的EBHSV和RCV

5、分別組成兩支不同的譜系，以上結(jié)果對認識RHDV的變異趨勢具有參考價值。利用軟件分析了分離毒株的分子量、疏水性、抗原性、表面可能性、密碼子偏愛性和二級結(jié)構(gòu)等分子結(jié)構(gòu)特征，并推測可能與其血凝性最相關(guān)的氨基酸位點為P2區(qū)的第304、305位，及E區(qū)的第432位；其次是F區(qū)的第480、508位。該分析結(jié)論在國內(nèi)外未見系統(tǒng)報道，為RHDV的分子生物學(xué)增添了新的資料。 根據(jù)GenBank中的衣殼蛋白VP60基因內(nèi)的保守序列，用Primer5

6、.0設(shè)計出1對可擴增出VP60基因內(nèi)部約496bp的部分片段的引物，建立了檢測RHDV的RT-PCR方法，并采用該RT-PCR方法對人工致死家兔體內(nèi)的RHDV進行了檢測；該方法特異性強，重復(fù)性好，靈敏度高，檢測RHDV的RNA的靈敏度可達2.15ug/ml。本研究建立的優(yōu)于HA的靈敏度高、特異性好的RT-PCR方法及其RHDV抗原檢測結(jié)果在國內(nèi)未見報道。 本研究分離鑒定出有不同血凝性兔出癥病毒株，并對其衣殼蛋白VP60基因進行了