缺氧誘導(dǎo)Neuroglobin上調(diào)的調(diào)控機制和以Neuroglobin為靶分子篩選神經(jīng)保護藥物的研究.pdf

1、第一部分：缺氧誘導(dǎo)Neuroglobin上調(diào)的調(diào)控機制
　　 Neuroglobin(Ngb)是新近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)特異性表達的攜氧蛋白，主要在脊椎動物神經(jīng)組織中高表達。以前的研究表明，缺氧可以誘導(dǎo)大腦中Ngb基因的表達的上調(diào)，而增加Ngb的表達可以進一步保護大腦免受缺血缺氧引發(fā)的損傷。然而，Ngb在缺氧條件下的調(diào)控機制尚不是很清楚。在這個研究中，我們發(fā)現(xiàn)小鼠Ngb基因的近端啟動子約554bp的序列高度保守，并且這段區(qū)域包含幾個保守的

2、NFκB和Egr1結(jié)合位點。過表達或者干擾轉(zhuǎn)錄因子p65，p50，Egr1或者Sp1能夠增加或者降低Ngb基因的表達。Ngb基因啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點突變研究以及凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)和染色體免疫沉淀實驗證明了NFκB家族成員(包括p65，p50和cRe1)以及Egr1和Sp1能夠與Ngb基因的啟動子區(qū)域結(jié)合。而且，我們研究發(fā)現(xiàn)一個κB3位點作為一個關(guān)鍵的順式作用原件介導(dǎo)了缺氧條件下誘導(dǎo)Ngb基因啟動子活性的上調(diào)。轉(zhuǎn)錄

3、因子NFκB(p65)，Sp1參與了調(diào)控缺氧條件下Ngb基因的表達上調(diào)。盡管我們在小鼠Ngb基因的近端啟動子區(qū)域并沒有發(fā)現(xiàn)HIF1α的保守結(jié)合位點，但是我們的結(jié)果表明HIF1α也參與了缺氧條件下Ngb基因的表達上調(diào)。因此，從這些結(jié)果中我們得出結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子NFκB，Egr1，Sp1通過與小鼠Ngb基因啟動子特異性的結(jié)合參與了對Ngb基因的調(diào)控，而NFκB，Sp1以及HIF1α參與了缺氧條件下小鼠Ngb基因的調(diào)控。
　　 第二部分

4、：以Neuroglobin為靶分子篩選神經(jīng)保護藥物研究
　　 中風(fēng)是引起人類死亡的主要疾病之一。以前的研究表明Ngb是一個能保護神經(jīng)免受缺血缺氧，氧壓以及神經(jīng)退行性病變的新的內(nèi)源性神經(jīng)保護蛋白。因此，上調(diào)Ngb的表達可能能作為一種干預(yù)和治療中風(fēng)以及相關(guān)性疾病的潛在的治療方法。為了篩選能夠上調(diào)Ngb表達的自然化合物，我們分別克隆了人以及小鼠約2kb的Ngb啟動子并構(gòu)建進入報告基因載體，然后進一步分別建立了人以及小鼠具有Ngb啟動子

5、報告基因的穩(wěn)定表達系。為了鑒定我們的人以及小鼠的穩(wěn)定表達系，我們初步篩選了一個包含約40個化合物的文庫。我們發(fā)現(xiàn)：Polydatin，Icariin，Genipin，Genistein，Daidzein，BiochaninA，F(xiàn)ormononetin能夠在小鼠的穩(wěn)定表達系中上調(diào)小鼠的Ngb基因啟動子活性。而Polydatin，Genistein，Daidzein，BiochaninA，F(xiàn)ormononetin能夠在人的穩(wěn)定表達細胞系中上

6、調(diào)人的Ngb基因啟動子活性。通過RT-PCR和Western blotting我們進一步確認了Polydatin，Genistein，F(xiàn)ormononetin能夠顯著的上調(diào)NgbmRNA水平和蛋白水平。而且我們的結(jié)果表明Polydatin和Formononetin能夠減少OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元的死亡。因此，我們的結(jié)果說明Polydatin和Formononetin可能可以作為潛在的神經(jīng)保護藥物，并且我們構(gòu)建的人和小鼠Ngb基因報告基因表達系