肝臟NK細(xì)胞的特性研究.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞（naturalkillercells，NKcell）是天然免疫系統(tǒng)的重要組成細(xì)胞。與T、B細(xì)胞不同，NK細(xì)胞無需致敏就可對(duì)腫瘤和病毒感染的靶細(xì)胞產(chǎn)生快速應(yīng)答，主要通過直接殺傷和分泌多種細(xì)胞因子的方式來發(fā)揮其效應(yīng)功能，是機(jī)體抵御外來病原體入侵的第一線細(xì)胞。近年來越來越多的研究表明，NK細(xì)胞并不是單一表型和功能的細(xì)胞，而是異質(zhì)性的細(xì)胞群體。NK細(xì)胞在人類和小鼠中的異質(zhì)性和相應(yīng)的分類均有報(bào)道。在小鼠中，根據(jù)NK細(xì)胞的組織分布特點(diǎn)

2、或不同發(fā)育成熟階段，NK細(xì)胞被劃分成表型和功能迥異的各種亞群。對(duì)NK細(xì)胞的細(xì)化分類研究，不僅有利于了解NK細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，更重要的是，對(duì)臨床NK細(xì)胞的治療也有著深遠(yuǎn)意義。
　　 肝臟是機(jī)體重要的免疫器官。它獨(dú)具特色的血液供應(yīng)機(jī)制和生理結(jié)構(gòu)，一方面需要肝臟免疫系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)才能維持穩(wěn)態(tài)，另一方面也造就了肝臟的免疫優(yōu)勢(shì)狀態(tài)。肝臟的天然免疫優(yōu)勢(shì)狀態(tài)主要體現(xiàn)在肝臟含有種類豐富和數(shù)量龐大的天然免疫細(xì)胞，其中，作為天然免疫系統(tǒng)成員的

3、NK細(xì)胞就富集于肝臟中。不僅如此，肝臟NK細(xì)胞的表型也十分特殊，一群表型不成熟的NK細(xì)胞始終在肝臟以高比例的形式存在，而在外周其它部位，占主導(dǎo)地位的是成熟表型的NK細(xì)胞。盡管這一現(xiàn)象早在十年前就被報(bào)道，但目前人們對(duì)肝臟這群特殊NK細(xì)胞的認(rèn)識(shí)仍然存在許多空白。它們是從骨髓發(fā)育而來的還是在肝臟中直接發(fā)育而來？它們?cè)诟闻K中是否行使特殊的功能？哪些因素能夠維持和影響它們的存在？這些問題至今還沒有得到解答的重要原因在于，對(duì)肝臟特有NK細(xì)胞表型和功

4、能的基本特性的認(rèn)識(shí)有限，并且缺乏特異性的分子標(biāo)志來對(duì)這群細(xì)胞進(jìn)行鑒定。本研究的目的之一就是拓寬對(duì)于肝臟特有NK細(xì)胞表型和功能的認(rèn)識(shí)，以及尋找特異性陽(yáng)性標(biāo)志。
　　 NK細(xì)胞在機(jī)體抗病毒感染的早期過程中發(fā)揮著重要作用。在許多不同的病毒感染模型中，肝臟NK細(xì)胞會(huì)驟增并活化，在揭示肝臟NK細(xì)胞的這種變化的同時(shí)，已有的這些研究關(guān)注點(diǎn)主要放在NK細(xì)胞參與的抗病毒反應(yīng)或炎癥反應(yīng)中的作用，而對(duì)前期過程中NK細(xì)胞是通過何種機(jī)制聚集于肝臟的研究卻

5、甚少，這是本研究將要解決的另一個(gè)問題。
　　 基于上述出發(fā)點(diǎn)，我們主要從以下兩大部分展開研究:
　　 Ⅰ.肝臟特有NK細(xì)胞的特性研究
　　 1.肝臟存在高比例的DX5-NK細(xì)胞
　　 首先，我們通過流式檢測(cè)DX5在C57BL/6小鼠的肝臟、脾臟、外周血、骨髓和腹股溝淋巴結(jié)中NK細(xì)胞上的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟NK細(xì)胞中有一半左右為DX5陰性，而其它組織器官中90％以上的NK細(xì)胞為DX5陽(yáng)性。
　　

6、 2.肝臟DX5-NK細(xì)胞與其它NK細(xì)胞亞群具有顯著差異
　　 對(duì)肝臟DX5-與DX5+NK細(xì)胞進(jìn)行小鼠全基因芯片分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩群NK細(xì)胞在基因表達(dá)譜方面存在廣泛的差異，表達(dá)有顯著差異的基因包括活化性/抑制性受體，細(xì)胞因子及受體，趨化因子及受體，粘附分子，殺傷功能效應(yīng)分子和轉(zhuǎn)錄因子等等，這些差異基因給后續(xù)肝臟特有NK細(xì)胞的特性研究帶來了啟示。我們又通過流式對(duì)這兩群NK細(xì)胞的表面分子表達(dá)進(jìn)行了大量對(duì)比，一方面驗(yàn)證了基因芯片中的

7、結(jié)果，另一方面則進(jìn)一步揭示了肝臟DX5-NK細(xì)胞具有不成熟NK細(xì)胞的表型特征。功能研究結(jié)果顯示，肝臟DX5-NK細(xì)胞的殺傷能力和分泌IFN-γ的能力比DX5+NK細(xì)胞要弱。
　　 此外，我們還對(duì)肝臟與其它臟器相對(duì)應(yīng)的NK細(xì)胞亞群之間進(jìn)行了表型比較。結(jié)果表明，肝臟中的DX5-NK細(xì)胞與其它臟器少量存在著的DX5-NK相比，表型上有一定差異，而肝臟中的與其它臟器中的DX5+NK相比，則沒有明顯區(qū)別。這說明過去報(bào)道的肝臟NK細(xì)胞表型特

8、殊主要?dú)w因于肝臟中DX5-NK細(xì)胞的存在。
　　 3.肝臟特有DX5-NK細(xì)胞的遷移和發(fā)育特性
　　 我們通過轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)研究了肝臟NK細(xì)胞亞群的發(fā)育和遷移特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)輸?shù)母闻KDX5-NK細(xì)胞在受體鼠中仍然只駐留于肝臟，并且維持原有的表型特征，而供者的DX5+NK細(xì)胞在受者的肝臟和脾臟中均有分布。由此我們認(rèn)為肝臟特有的DX5-NK細(xì)胞是肝臟駐留的細(xì)胞，而且在沒有外界刺激的情況下，這群細(xì)胞不會(huì)進(jìn)一步發(fā)育分化而獲得成熟的表

9、型;與此相反，DX5+NK細(xì)胞則具有很強(qiáng)的遷移能力，在全身廣泛分布，代表著絕大部分的外周NK細(xì)胞。
　　 4.CD49a作為肝臟特有DX5-NK細(xì)胞的特異性標(biāo)志
　　 基因芯片的結(jié)果揭示肝臟DX5-NK細(xì)胞高表達(dá)CD49a，流式檢測(cè)則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)肝臟DX5-NK細(xì)胞幾乎全為CD49a陽(yáng)性，而肝臟DX5+NK細(xì)胞和其它臟器NK細(xì)胞幾乎不表達(dá)CD49a。在RAG-1缺陷鼠和BALB/c小鼠中，也同樣發(fā)現(xiàn)肝臟特異性存在一群CD4

10、9a+NK細(xì)胞。綜上所述，CD49a分子能夠作為肝臟特有NK細(xì)胞的特異性標(biāo)志。
　　 5.肝臟特有NK細(xì)胞的特殊功能已有的報(bào)道發(fā)現(xiàn)肝臟NK能夠介導(dǎo)半抗原特異性的超敏反應(yīng)，并且該過程依賴于CXCR6，但是具體由哪個(gè)NK細(xì)胞亞群所介導(dǎo)卻并不清楚。我們的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCR6在肝臟特有NK細(xì)胞上表達(dá)較高，并且肝臟特有NK細(xì)胞能夠介導(dǎo)超敏反應(yīng)，而在外周中廣泛存在的NK細(xì)胞亞群則不能;此外，半抗原致敏后，攜帶半抗原的細(xì)胞能夠進(jìn)入肝臟，為

11、肝臟特有NK細(xì)胞發(fā)揮記憶功能提供了必要基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論Ⅰ:本文對(duì)肝臟NK細(xì)胞的表型，功能和遷移發(fā)育特性進(jìn)行了系統(tǒng)性描述，為組織微環(huán)境與NK細(xì)胞之間的互相影響及其內(nèi)在機(jī)理提供了參考依據(jù)，對(duì)研究NK細(xì)胞在中樞淋巴器官之外的場(chǎng)所發(fā)育分化提供了重要線索，也是對(duì)已有關(guān)于NK細(xì)胞基本生物學(xué)特征的認(rèn)識(shí)的重要補(bǔ)充。
　　 Ⅱ.病毒感染過程中CD62L參與NK細(xì)胞在肝臟的聚集和成熟
　　 1.CD62L在靜息NK細(xì)胞上的表達(dá)特性

12、
　　 對(duì)正常C57BL/6小鼠各臟器NK細(xì)胞上CD62L表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示，CD62L在肝臟NK細(xì)胞上的表達(dá)水平最低（不到50％），其次是骨髓，而脾臟、外周血和淋巴結(jié)的NK細(xì)胞大部分為CD62L陽(yáng)性;進(jìn)一步對(duì)CD62L-和CD62L+NK細(xì)胞的表型進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞成熟相關(guān)的標(biāo)志在CD62L+NK細(xì)胞上表達(dá)較高;對(duì)不同年齡小鼠的NK細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD62L的表達(dá)是從無到有，逐漸上升的過程;此外，轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)輸?shù)?/p>

13、CD62L-NK細(xì)胞可以發(fā)育分化成CD62L陽(yáng)性，但轉(zhuǎn)輸?shù)腃D62L+NK細(xì)胞仍然為CD62L陽(yáng)性，說明NK細(xì)胞獲得CD62L的表達(dá)是一個(gè)不可逆的過程。
　　 總之，這部分結(jié)果說明在靜息狀態(tài)下，CD62L-和CD62LNK細(xì)胞具有不同的組織分布特性，并且相比較而言，CD62L+NK細(xì)胞代表著更成熟的NK細(xì)胞群體。
　　 2.PolyI∶C引起肝臟NK細(xì)胞變化
　　 我們對(duì)小鼠注射polyI∶C來模擬RNA病毒感染

14、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在注射后的18小時(shí)即觀察到肝臟NK細(xì)胞的大量增加和活化，并且與靜息狀態(tài)相比，此時(shí)肝臟NK細(xì)胞表型更為成熟。通過轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，polyI∶C刺激能夠加劇肝臟CD62L-NK細(xì)胞向CD62L+轉(zhuǎn)變，同時(shí)促進(jìn)外周NK細(xì)胞向肝臟聚集。
　　 3.PolyI∶C引起肝臟NK細(xì)胞的變化依賴于CD62L
　　 在對(duì)小鼠給予polyI∶C刺激前預(yù)先阻斷CD62L，則會(huì)觀察到NK細(xì)胞在肝臟中的聚集受到抑制，并且肝臟NK細(xì)胞表型

15、的進(jìn)一步成熟也得到抑制，這說明polyI∶C刺激引起的肝臟NK細(xì)胞的變化依賴于CD62L。
　　 4.CD62L的阻斷抑制腺病毒感染引起的肝臟NK細(xì)胞變化
　　 為了驗(yàn)證上述polyI∶C引起的現(xiàn)象和機(jī)制是否也適用于其它病毒感染模型。我們用到了DNA病毒——腺病毒感染的小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺病毒感染后小鼠肝臟NK細(xì)胞的比例迅速增多并且CD62L表達(dá)水平顯著上調(diào)，而如果預(yù)先阻斷CD62L，肝臟NK細(xì)胞的增加和成熟就會(huì)受到抑