乙肝相關性肝病肝臟內(nèi)干細胞樣細胞的特性和定向分化.pdf

1、前言： 目前全球有3.5億乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性攜帶者，每年約1百萬死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化、原發(fā)性肝癌。中國屬HBV感染高流行國家，約有1.2億慢性HBV攜帶者和3000萬慢性乙型肝炎患者，這些慢性乙型肝炎患者很容易發(fā)展成肝硬化、肝癌。因此，慢性乙型肝炎是嚴重威脅人類健康的疾病之一，但是HBV的精確致病機制尚未完全闡明。盡管外科技術和各種輔助治療手段的完善，但是肝臟的功能衰竭和

2、肝癌手術切除后的復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是乙肝相關性肝病的主要死亡原因。因此，乙型肝炎病毒慢性感染導致的肝臟纖維化、肝硬化甚至肝細胞肝癌仍然是基礎和臨床研究的熱點。盡管在肝臟病毒感染后所致的肝臟纖維化在一定的條件下可以實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，但是目前的研究結(jié)果僅僅局限于動物模型中，尤其是在晚期肝硬化形成后，肝臟的病理改變已無法逆轉(zhuǎn)。 眾所周知，人體多種組織器官中存在干細胞，這些細胞在器官損傷時是組織再生和修復。研究認為，組織器官中的干細胞與腫瘤細胞有著

3、密切的關系且具有某些共同特征。最近的研究表明，組織器官中的成體干細胞可能是組織細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的靶細胞。在發(fā)生組織損傷的器官中，慢性感染和組織再生可以導致組織正常的干細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而成為癌細胞，而這些發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的干細胞就被稱為腫瘤干細胞。 乙型肝炎病毒的常常導致肝臟的慢性感染，漫長的病程有往往導致肝臟硬化和肝癌。干細胞樣細胞在肝臟的慢性感染時發(fā)生富集且其數(shù)量與肝臟病變的嚴重程度呈顯著的正相關，而這些干細胞直接參與了動物模型中

4、肝癌的發(fā)生。因此肝臟干細胞可能在人類肝癌的形成中扮演了重要的角色，鑒定這些細胞將有助于我們對人體肝癌發(fā)生的理解和認識。 新近的研究表明，在體外特定的誘導條件下，具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞(MSCs)在特定的誘導條件下可以通過間質(zhì)-上皮(MET)途徑分化為成熟肝細胞。同時有研究表明，間充質(zhì)干細胞和纖維母細胞之間有著密切的關系，它們可能代表相同細胞的不同功能階段。這些纖維母細胞不但表達間充質(zhì)干細胞的表面標記，而且在特定的誘導條件

5、下，這些細胞表現(xiàn)出多向分化潛能。因此，在以往很多研究中，間充質(zhì)干細胞和纖維母細胞的概念經(jīng)常交互使用。這些關于纖維母細胞的研究提示我們肝硬化肝臟內(nèi)的纖維母細胞同樣也可能具有干細胞的細胞特性。 在本研究中，我們首先用免疫組化的方法觀察了在肝硬化、肝癌和癌旁組織中干細胞表面標記的表達，將來源于乙肝肝硬化和肝癌癌旁組織中的細胞種植入BN)(小鼠，以探討這些細胞的致瘤特性。在體外實驗中，我們進一步檢測了不同來源的組織干細胞樣細胞的增殖、自

6、我更新和克隆能力。之后，在成功分離出肝硬化和肝癌組織中纖維母細胞后，用多種方法觀察了這些纖維母細胞的干細胞表面標記的表達情況和分化潛能。我們認為，在體外的誘導條件下，肝硬化和肝癌組織內(nèi)的纖維母細胞可以增殖和分化為具有分泌功能的成熟肝細胞的能力。 材料和方法： 我們收集了我院20例手術切除的肝癌組織、相應的癌旁組織和10肝硬化組織標本。從以上的三種組織中我們分別挑選了5例組織進行和免疫缺陷小鼠的組織塊種植和分離培養(yǎng)后的纖維

7、母細胞的細胞種植。 免疫組織化學染色(IHC)ABC法檢測三種組織樣本中c-kit、CD133、CD90、CD34、CKl8和CK-19等。以PSB代替一抗作為陰性對照。分離不同組織樣本中的纖維母細胞，分別以細胞免疫組化、流式細胞術、免疫熒光技術和蛋白免疫印跡技術等實驗方法，觀察纖維母細胞CD73、CD44、CD34、CIM5、CD90、c-kit和CD133等標記進行了細胞免疫表型的分析，同時應用細胞免疫熒光的方法觀察細胞中波

8、形蛋白、結(jié)蛋白、纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、纖維母細胞特異抗原、CK-18、CK-19和白蛋白等的表達情況。 在不同的體外培養(yǎng)的條件下，我們觀察了來源于三種不同組織中的細胞的體外增殖、自我更新和克隆形成能力；同時，我們對來源于肝硬化肝臟和肝癌組織內(nèi)的纖維母細胞細胞在不同的培養(yǎng)階段的細胞形態(tài)變化和細胞內(nèi)相關基因和蛋白的表達進行了觀察。 為了評估不同組織和組織細胞的致瘤特性，肝硬化和肝癌癌旁組織各5例樣本在MEM培養(yǎng)基

9、中被剪成1-2 mm3大小的組織塊，然后用已經(jīng)配制好的PBS液洗滌2次，各樣本稱取50毫克，以18號穿刺針無菌條件下接種于免疫缺陷小鼠左側(cè)腋窩皮下，同時把4例來源于肝癌的纖維母細胞按1X10E6／只進行了細胞皮下注射。記錄成瘤時間并計算成瘤率，觀察移植瘤大小、形態(tài)、質(zhì)地及活動度。五個月后，拉頸處死所有小鼠，切取腫瘤組織標本并分別行病理學檢查(10％甲醛固定后，HE染色)及免疫組織化學檢查。 在成功分離不同組織樣本中的纖維母細胞的

10、基礎上，采用體外誘導分化的方法，對不同來源的纖維母細胞向成熟肝細胞的分化特性進行了研究。 結(jié)果： 對肝硬化、肝癌和癌旁組織中的干細胞表面標記的免疫組化分析結(jié)果顯示，非癌組織中的干細胞標記的表達高于癌組織。不同組織內(nèi)呈現(xiàn)不同的干細胞表達模式。CD34和CD90陽性表達部位多集中在增殖的膽管上，它們在細胞形態(tài)學上往往代表肝臟祖細胞；CD133和c-kit陽性細胞則多分布在肝或肝癌實質(zhì)中，它們在形態(tài)和空間位置上類似過渡性的中間

11、肝細胞。CK-18和CK-19陽性的細胞在多數(shù)的組織樣本中都有表達，部分CK-18和CK-19陽性的細胞散在分布于硬化肝臟的實質(zhì)組織中，它們在細胞形態(tài)上表現(xiàn)出肝細胞的圓核和多邊形細胞膜，這些細胞代表過渡性肝細胞。 體外實驗也表明，來源于乙肝相關性肝硬化和肝癌癌旁組織內(nèi)的細胞具有高度的增殖、自我更新和克隆形成能力。 肝硬化肝臟和肝癌組織內(nèi)的少數(shù)纖維母細胞表達間充質(zhì)干細胞的細胞表面標記CD73和CD44而無骨髓造血干細胞的細

12、胞表面標記CD34和CIM5的表達；少部分的纖維母細胞表達干細胞表面標記CD90、c-kit和CD133。除了極少數(shù)的細胞表達α-平滑肌肌動蛋白外，幾乎所有細胞表達波形蛋白、結(jié)蛋白、纖維連接蛋白、纖維母細胞特異抗原。此外，極少的細胞表達CK-18或CK-19但未發(fā)現(xiàn)白蛋白陽性細胞。 在體外特異性的誘導條件下，肝硬化肝臟內(nèi)的纖維母細胞以一種時間依賴的方式逐漸分化為肝細胞所特有的多邊形細胞形態(tài)，而在此過程中伴隨著不同肝系細胞蛋白標記

13、的表達。纖維母細胞胞體由梭型或長梭形形態(tài)，培養(yǎng)2周后，胞體增大、變寬，形狀不規(guī)則。培養(yǎng)周后，細胞進一步縮短，變寬，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸出現(xiàn)肝細胞典型的多邊形。 對肝硬化、肝癌和癌旁組織在BNX小鼠體內(nèi)的成瘤性研究發(fā)現(xiàn)，種植了癌旁組織的兩組共三只小鼠長出了腫塊，肉眼觀腫塊直徑大小都約1cm，組織HE染色表明腫塊中心有大片的壞死區(qū)域，鏡下觀，組織實質(zhì)由大量的實質(zhì)細胞團塊組成，且這些細胞具有高核／漿比，細胞的排列紊亂，失去正常

14、的組織結(jié)構和極性。同時，組織免疫組化染色發(fā)現(xiàn)有CD133和c-kit陽性表達，而這些陽性細胞在形態(tài)學上都表現(xiàn)出卵圓細胞的特征。來源于肝癌、經(jīng)過長期體外培養(yǎng)的纖維母細胞未發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)有腫塊形成。 結(jié)論： 在乙型肝炎引起的肝硬化、肝癌和癌旁組織中有多種干細胞表面標記的表達，這些干細胞表明標記呈現(xiàn)不同的表達模式并代表不同的細胞類型。來源于乙肝肝硬化和肝癌癌旁組織內(nèi)的細胞具有高度的增殖、自我更新和克隆形成能力。這些組織內(nèi)干細胞

15、樣細胞具有高度的致瘤特性，并可能存在著肝癌腫瘤干細胞。這些研究結(jié)果進一步完善了肝癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移機制，為乙型肝炎引起的肝臟疾病的防治提供了新的思路。 乙型肝炎慢性感染引起的肝硬化和肝細胞肝癌組織內(nèi)的纖維母細胞具有間充質(zhì)干細胞的細胞特性，在體外條件下，可以分化為具有特異性功能的成熟肝細胞。因此，這些纖維母細胞可以作為組織工程的肝臟肝細胞的來源。同時，肝硬化肝臟內(nèi)的纖維母細胞通過間質(zhì)一上皮轉(zhuǎn)變(MET)分化為成熟肝細胞也提示，傳統(tǒng)意義