NK細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞協(xié)同介導(dǎo)poly I：C-D-GalN誘發(fā)的肝臟損傷.pdf

1、肝臟作為一個(gè)天然免疫器官，包含了眾多的天然免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞。這些細(xì)胞大量聚集在肝臟中，表明它們?cè)诟闻K生物學(xué)中具有重要的地位，能夠?yàn)闄C(jī)體提供抵御腫瘤和外來(lái)抗原入侵的免疫監(jiān)視及保護(hù)。但是近年來(lái)的研究表明過(guò)度的免疫細(xì)胞活化有時(shí)可能對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行意想不到的自身攻擊，引起自身免疫性的肝臟損傷。Kupffer細(xì)胞被細(xì)菌的外毒素(LPS)活化后能分泌大量的炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)肝臟損傷；NKT細(xì)胞被刀豆蛋白A(ConA)和α-半乳糖

2、神經(jīng)酰胺(α-Galcer)激活后通過(guò)分泌細(xì)胞因子和直接殺傷肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致肝臟嚴(yán)重的損傷。NK細(xì)胞同樣是肝臟中重要的天然免疫細(xì)胞，占肝臟淋巴細(xì)胞總數(shù)的30％-40％。很多研究提示NK細(xì)胞參與了人類(lèi)肝炎發(fā)病的過(guò)程，在小鼠模型的研究中也發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞過(guò)度活化會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷，但是NK細(xì)胞通過(guò)哪些機(jī)制介導(dǎo)肝臟損傷尚未研究清楚。 本研究通過(guò)給小鼠同時(shí)注射poly I：C(1ug/只)和D-GaIN(10mg/只)，建立了一種比較新的爆發(fā)性肝

3、炎的模型，有利于深入探討肝臟天然免疫細(xì)胞在肝臟免疫損傷中的作用及機(jī)理。我們采用賴(lài)氏法檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶ALT水平、組織H-E染色觀(guān)察肝臟病理學(xué)變化，并利用上述指標(biāo)綜合評(píng)估肝細(xì)胞損傷程度；通過(guò)細(xì)胞清除研究特定淋巴細(xì)胞群在肝臟損傷過(guò)程中的作用；采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各淋巴細(xì)胞亞群的表型，活化狀態(tài)以及細(xì)胞因子分泌功能；用ELISA法和實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)肝臟中、血清中以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平；我們用MACS磁珠分離方法分離純化肝臟中的NK

4、細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞，并且在體外poly I：C刺激下共同培養(yǎng)，同時(shí)在體內(nèi)和體外運(yùn)用特異抗體中和實(shí)驗(yàn)觀(guān)察NK細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞間相互作用的分子機(jī)制。通過(guò)上述研究方法取得的結(jié)果如下： 1.poly I：C能夠在D-GaIN鼠中引起嚴(yán)重的肝臟損傷 D-GalN致敏的小鼠接受poly I：C注射后爆發(fā)嚴(yán)重的肝臟損傷。聯(lián)合注射18小時(shí)后肝臟轉(zhuǎn)氨酶水平可以達(dá)到14560±2910 IU/L，直到48小時(shí)才基本恢復(fù)到正常

5、水平。通過(guò)HE染色可以看到poly I：C和D-GalN聯(lián)合注射鼠肝臟有局部充血和肝細(xì)胞的壞死。這種嚴(yán)重的肝損傷現(xiàn)象只在poly I：C和D-GalN聯(lián)合注射鼠中可見(jiàn)，單獨(dú)注射poly I：C或者D-GalN都不會(huì)引起小鼠轉(zhuǎn)氨酶的升高和肝臟的壞死。而且poly I：C/D-GalN誘導(dǎo)的損傷是肝臟特異性的，小鼠的肺臟、結(jié)腸和小腸都沒(méi)有明顯的損傷。 2.poly I：C和D-GaIN誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝損傷是NK細(xì)胞介導(dǎo)的 流式

6、細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，poly I：C/D-GalN能夠誘導(dǎo)大量的NK細(xì)胞在肝臟局部聚集，而且這些NK細(xì)胞活化程度增強(qiáng)，表現(xiàn)在細(xì)胞表面CD69分子表達(dá)水平升高。體內(nèi)清除NK細(xì)胞后，poly I：C/D-GalN誘導(dǎo)的肝臟損傷明顯降低。Poly I：C/D-GalN同樣能夠在SCID鼠中引發(fā)嚴(yán)重的肝臟損傷，這一結(jié)果進(jìn)一步證明了NK細(xì)胞是該模型中導(dǎo)致肝臟損傷的重要效應(yīng)細(xì)胞，而且其發(fā)揮作用時(shí)不依賴(lài)T細(xì)胞和B細(xì)胞的協(xié)助。 3.在poly I

7、：C和D-GalN聯(lián)合注射小鼠中NK細(xì)胞的活化依賴(lài)Kupffer細(xì)胞的存在 由脂質(zhì)體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞清除實(shí)驗(yàn)表明，poly I：C和D-GalN聯(lián)合注射誘導(dǎo)的肝臟損傷是依賴(lài)Kupffer細(xì)胞的。Kupffer細(xì)胞被清除后，poly I：C/D-GalN不能夠引起血清中轉(zhuǎn)氨酶水平的急劇升高。和Kupffer細(xì)胞未清除小鼠相比，polyI：C/D-GalN注射后，肝臟中NK細(xì)胞的比例降低，分泌IFN-γ的NK細(xì)胞也明顯減少。

8、4.NK細(xì)胞分泌的IFN-γ和Kupffer細(xì)胞分泌的TNF-α仿同誘導(dǎo)肝臟損傷ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，poly I：C/D-GalN注射后，血清中IFN-γ和TNF-α的量顯著增多，在18小時(shí)達(dá)到頂峰，48小時(shí)回復(fù)到正常水平，這和轉(zhuǎn)氨酶的變化是一致的。而定量PCR的結(jié)果表明，在肝臟局部，IFN-γ的RNA轉(zhuǎn)錄水平2小時(shí)就開(kāi)始升高，4小時(shí)到峰值，24小時(shí)回復(fù)到正常水平；TNF-α RNA的轉(zhuǎn)錄水平則在2小時(shí)就可以達(dá)到峰值，48小時(shí)回落到

9、正常值。中和體內(nèi)的TNF-α后，poly I：C/D-GalN誘導(dǎo)的肝臟損傷明顯減弱。給IFN-γ缺陷鼠注射poly I：C/D-GalN后，血清中轉(zhuǎn)氨酶的水平較野生型鼠也顯著降低。表明IFN-γ和TNF-α在該模型中參與了肝臟損傷的形成。給予外源性重組IFN-γ的實(shí)驗(yàn)表明，D-GalN能夠使肝臟對(duì)IFN-γ造成的損傷更加敏感。而且給D-GalN致敏鼠注射IFN-γ和TNF-α?xí)r，兩種細(xì)胞因子同時(shí)注射誘導(dǎo)的肝臟損傷遠(yuǎn)大于單獨(dú)注射其中一種

10、細(xì)胞因子引發(fā)的損傷，表明IFN-γ和TNF-α在介導(dǎo)肝臟損傷時(shí)有協(xié)同效應(yīng)。 另外，胞內(nèi)細(xì)胞因子染色實(shí)驗(yàn)證明，IFN-γ主要是由肝臟中的NK細(xì)胞分泌的，和T細(xì)胞、NKT細(xì)胞無(wú)關(guān)。當(dāng)用抗體將NK細(xì)胞清除后，poly I：C/D-GalN誘導(dǎo)的IFN-γ水平就顯著降低；而免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)則證明TNF-α主要是由肝臟中的Kupffer細(xì)胞分泌的，清除Kupffer細(xì)胞后可以明顯降低血清中TNF-α的含量。 5.活化后的NK細(xì)胞和

11、Kupffer細(xì)胞通過(guò)NKG2D/Rae1相互作用 通過(guò)RT-PCR方法對(duì)poly I：C/D-GalN注射后肝臟組織的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)NKG2D的配體Rae1轉(zhuǎn)錄水平升高，另一個(gè)配體Mult1的RNA轉(zhuǎn)錄水平基本沒(méi)有變化。進(jìn)一步的流式結(jié)果證明了poly I：C/D-GalN注射后，肝臟中Kupffer細(xì)胞表達(dá)Rael，NK細(xì)胞表面的NKG2D表達(dá)沒(méi)有變化。阻斷小鼠體內(nèi)NKG2D通路后，poly I：C/D-GalN誘導(dǎo)的肝臟損傷

12、明顯減弱，血清中IFN-γ的含量也顯著降低。體外純化的NK細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了Kupffer細(xì)胞依賴(lài)NKG2D和Rae1的識(shí)別促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-γ。 6.IL-12和IL-18也參與了NK細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞之間的相互作用 ELISA實(shí)驗(yàn)顯示poly I：C/D-GalN能夠誘導(dǎo)肝臟局部和血清中IL-12和IL-18的表達(dá)水平升高，在注射后12小時(shí)和18小時(shí)明顯高于0小時(shí)，提示IL

13、-12和IL-18可能參與了肝臟損傷的過(guò)程。體外NK細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，分別中和IL-12和IL-18后，poly I：C刺激產(chǎn)生的IFN-γ明顯降低，預(yù)示IL-12和IL-18在NK細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的相互作用中起到了積極的作用。 結(jié)論：本文描述了一個(gè)NK細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠爆發(fā)性肝炎模型，這對(duì)于已經(jīng)存在的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎模型和NKT細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎模型是個(gè)很好的補(bǔ)充。同時(shí)，本文首次描述了肝臟中的NK