解聚素金屬蛋白酶10真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的: 構(gòu)建重組pcDNA3.1-mADAM10真核表達(dá)質(zhì)粒，觀察mADAM10在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)，為下一步探索白血病形成機(jī)制提供有利工具。
　　 方法: 1 從小鼠腦組織中提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增mADAM10基因，克隆至pCR2.1載體，酶切及測(cè)序鑒定，分別雙酶切鑒定正確的pCR2.1-mADAM10載體和表達(dá)載體pcDNA3.1，膠回收目的片段，通過T4連接酶連接mADAM10及pcDNA3.1，

2、獲得重組表達(dá)載體pcDNA3.1-mADAM10；
　　 2 通過脂質(zhì)體法將所得到的重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選，獲得表達(dá)mADAM10的細(xì)胞克隆；
　　 3 采用RT-PCR及Western-blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后mADAM10基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.從小鼠腦組織中獲得mADAM10基因，克隆至pCR2.1載體，構(gòu)建出pCR2.1-mADAM10；酶切

3、后經(jīng)T4連接酶，將mADAM10與表達(dá)載體pcDNA3.1連接，獲得重組表達(dá)載體pcDNA3.1-mADAM10。重組載體經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定均完全正確；
　　 2. 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mADAM10轉(zhuǎn)染至ADAM10陰性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)到mADAM10基因的轉(zhuǎn)錄，Western-blot結(jié)果顯示mADAM10具有良好的表達(dá)。
　　 結(jié)論: 成功制備了含mADAM10基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染