眼動(dòng)脈注射B16瘤細(xì)胞眼葡萄膜內(nèi)黑色素瘤動(dòng)物模型的建立.pdf

1、背景與目的： 葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UMM)為成年人眼內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。在西方國家，葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病主要見于年齡大于50歲的人群，而國內(nèi)臨床資料顯示相當(dāng)一部分患者為20～30歲的青壯年。發(fā)生在眼部的葡萄膜黑色素瘤，不但可以在眼球局部形成滲出或腫瘤生長頂推其前方的視網(wǎng)膜，引起視網(wǎng)膜的脫離或者直接的侵襲眼內(nèi)其它包括視網(wǎng)膜、視神經(jīng)等重要組織，導(dǎo)致視力的喪失，更為重要的是葡萄膜黑色素瘤可以通過血液循環(huán)

2、，轉(zhuǎn)移至肝臟、肺臟等全身重要器官，引起死亡，對患者造成極大的危害。 盡管目前葡萄膜黑色素瘤的臨床診斷水平已大大提高，但相當(dāng)一部分患者在診斷出黑色素瘤之前，已經(jīng)發(fā)生了全身的轉(zhuǎn)移。圍繞葡萄膜黑色素瘤的治療，出現(xiàn)了許多新的局部治療方法比如經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?、荷電粒子放射治療?06Ru/106Rh鞏膜外貼附放射療法以及各種新型的化療和免疫療法等，但多中心的臨床病例對照研究發(fā)現(xiàn)，這些治療方法較傳統(tǒng)的眼球摘除，在降低患者死亡率方面并沒有得到改

3、善，葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生及其轉(zhuǎn)移的機(jī)理仍不是十分的清楚。解決上述問題的條件之一，需要一個(gè)理想的、能較好模擬人葡萄膜黑色素瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移全過程的葡萄膜內(nèi)黑色素瘤動(dòng)物模型，這也是開展葡萄膜黑色瘤研究必要的基礎(chǔ)和前提，但至今，仍缺乏這樣的動(dòng)物模型。 本研究旨在經(jīng)眼動(dòng)脈注射B16瘤細(xì)胞，探討瘤細(xì)胞通過血液達(dá)眼內(nèi)，瘤細(xì)胞在葡萄膜內(nèi)及眼內(nèi)生長、侵襲、擴(kuò)散的規(guī)律，建立具有正常免疫功能且沒有任何眼部創(chuàng)傷的、并較易獲得、生長在葡萄膜內(nèi)的葡萄膜

4、黑色素瘤動(dòng)物模型。 方法： 將培養(yǎng)的B16瘤細(xì)胞注射到眼動(dòng)脈經(jīng)血液達(dá)C57BL/6J小鼠眼內(nèi)，形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)染色，觀察小鼠眼內(nèi)葡萄膜內(nèi)黑色素瘤形成情況，及其局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Dil染色標(biāo)記B16瘤細(xì)胞后注射到眼動(dòng)脈經(jīng)血液達(dá)C57BL/6J小鼠眼內(nèi)1-3天，采用視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜鋪平片以及冰凍切片分別從整體和切面兩個(gè)角度，熒光顯微鏡下觀察B16瘤細(xì)胞成瘤前在視網(wǎng)膜及葡萄膜內(nèi)的分布。同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀，檢測全身各主要臟器

5、及血液內(nèi)的B16瘤細(xì)胞分布狀況。葡萄膜內(nèi)成瘤后的部分瘤組織，重新取材進(jìn)行體外培養(yǎng)。 結(jié)果： 1.在33只實(shí)驗(yàn)的小鼠眼中，除其中2只處死過早，未形成腫瘤外，其余31只均能見到脈絡(luò)膜和(或)睫狀體內(nèi)的腫瘤形成。經(jīng)眼動(dòng)脈注射后B16瘤細(xì)胞后的第3天開始，可以在小鼠脈絡(luò)膜及睫狀體兩處同時(shí)觀察到腫瘤細(xì)胞的生長。且隨著時(shí)間的延長，腫瘤的體積不斷增大，并向四周侵襲。后期，位于葡萄膜內(nèi)的腫瘤可侵犯鞏膜和角膜，造成鞏膜外及眼球外腫瘤生長。

6、 2.B16瘤細(xì)胞注射后，全身各主要臟器及血液內(nèi)均能檢測到瘤細(xì)胞，其瘤細(xì)胞數(shù)量略有不同。心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和血液中瘤細(xì)胞比例分別是0.18％±0.06(n=12)、0.56％±0.42(n=12)、0.26％±0.07(n=12)、0.66％±0.3(n=12)、0.27％±0.12(n=12)、0.12％±0.04(n=12)；但未能在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)檢測到B16瘤細(xì)胞。 3.經(jīng)眼動(dòng)脈注射的B16瘤細(xì)胞注射后的第1天

7、，視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜內(nèi)均觀察到腫瘤細(xì)胞的分布。手術(shù)后的第3天，分布于視網(wǎng)膜內(nèi)的腫瘤細(xì)胞絕大部分消失，僅零星殘留幾個(gè)且未見其增殖；而位于脈絡(luò)膜內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，大部分存活下來并發(fā)生克隆樣增殖。 4.組織塊貼壁生長法及胰蛋白酶消化法，均能從動(dòng)物葡萄膜內(nèi)的實(shí)體瘤中培養(yǎng)出腫瘤細(xì)胞。取葡萄膜內(nèi)實(shí)體瘤培養(yǎng)的瘤細(xì)胞體積稍變大，細(xì)胞突起增長、數(shù)量增多，可頻見核分裂像，且能形成管腔樣結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色顯示：取葡萄膜內(nèi)實(shí)體瘤培養(yǎng)的瘤細(xì)胞及細(xì)胞株細(xì)胞都表

8、現(xiàn)為HMB45、S100、VIM陽性，GPAP、NSE和CK陰性，證明培養(yǎng)的細(xì)胞仍然是B16腫瘤細(xì)胞。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)研究，在沒有損傷任何眼部結(jié)構(gòu)的前提下，將C57BL/6J小鼠皮膚來源的黑色素瘤細(xì)胞株B16瘤細(xì)胞，經(jīng)眼動(dòng)脈注射通過血循環(huán)達(dá)具有正常免疫功能的C57BL/6J小鼠的眼內(nèi)，成功建立了同時(shí)位于脈絡(luò)膜及睫狀體兩部位的葡萄膜內(nèi)黑色素瘤模型。該模型較好地模擬了人黑色素瘤細(xì)胞在葡萄膜內(nèi)生長、侵襲等過程。 2

9、.經(jīng)眼動(dòng)脈注射的B16瘤細(xì)胞通過血循環(huán)達(dá)眼內(nèi)，只在富含色素的脈絡(luò)膜和睫狀體部位生長并形成腫瘤，相鄰的視網(wǎng)膜組織內(nèi)卻沒有腫瘤形成，證明腫瘤細(xì)胞具有“歸巢”的潛能。 3.本實(shí)驗(yàn)將B16瘤細(xì)胞經(jīng)眼動(dòng)脈注射通過血循環(huán)達(dá)眼內(nèi)，在葡萄膜內(nèi)成瘤后取其實(shí)體瘤組織進(jìn)行培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞均能在體外生長，提示B16瘤細(xì)胞經(jīng)眼動(dòng)脈注射通過血循環(huán)達(dá)眼內(nèi)，在葡萄膜內(nèi)成瘤的腫瘤細(xì)胞，仍是具有較強(qiáng)生長優(yōu)勢的瘤細(xì)胞，盡管在體內(nèi)環(huán)境的作用下，B16瘤細(xì)胞在形態(tài)學(xué)及其生