阿維A酸聯(lián)合干擾素對小鼠黑色素瘤細胞株B16作用的研究.pdf

1、目的：黑色素瘤（malignant malanoma，MM）是一種嚴重威脅人們生命的腫瘤，占皮膚惡性腫瘤的第三位，具有惡性程度高、侵襲力強的臨床特點。外科手術仍是治療黑色素瘤的首選方法，但是即使外科手術切除，預后仍較差。因此，尋求有效的藥物治療成為黑色素瘤治療領域的研究熱點。
　　 維甲酸類（retinoids）包括維生素A的天然及人工合成的衍生物，具有廣泛的生物活性。維甲酸對正常上皮的分化具有重要的調節(jié)作用，臨床上已被用來治療

2、和預防許多皮膚病及皮膚腫瘤。最近研究表明，維甲酸對多種惡性腫瘤有誘導分化、抑制增殖及誘導凋亡等的作用，干擾素具有抗腫瘤和免疫調節(jié)作用，維甲酸和干擾素分別屬于外源性和內源性的分化誘導劑，二者聯(lián)合應用，可以提高腫瘤對誘導劑的敏感性，從而降低單藥劑量，減少毒副作用，也可提高治療效果。但在皮膚黑色素瘤方面的研究未見報道。
　　 維甲酸類是一種有效預防皮膚腫瘤的藥物，其抗皮膚黑色素瘤的機制尚未完全闡明。本研究旨以小鼠黑色素瘤紀胞株B16為

3、研究對象，探討維甲酸、干擾素在不同濃度、不同作用時間對皮膚黑色素瘤細胞增殖抑制作用及形態(tài)分化的影響，篩選兩藥聯(lián)合應用的最佳作用時間和劑量；探討兩藥聯(lián)合應用對小鼠B16細胞表達PTEN的影響。為干擾素、維甲酸類藥物誘導皮膚腫瘤細胞凋亡的基礎研究及臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1細胞培養(yǎng)
　　 將B16細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（含青霉素100U/ml，含鏈霉素100U/ml，

4、PH7.2）中，置于37℃、飽和濕度、5％CO2的培養(yǎng)箱內常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　 2 MTT比色分析法檢測阿維A和干擾素對小鼠B16細胞增殖抑制的影響。
　　 2.1不同濃度阿維A（0.1umol/L、1.0umol/L、10umol/L）分別作用24、48、72小時后對B16細胞增殖的影響。
　　 2.2不同濃度干擾素（500u/ml、1000u/ml、2000u/ml）分別作用24、48、72小時后對B16細胞

5、增殖的影響。
　　 2.3聯(lián)合應用1.0umol/L阿維A和1000u/ml干擾素作用48小時后對B16細胞增殖的影響，采用金氏公式分析相互作用指數(shù)（q），評價聯(lián)合后的效應。
　　 3倒置相差顯微鏡觀察各組藥物處理后對小鼠B16細胞的細胞分化及形態(tài)的影響
　　 4應用免疫細胞化學s-p法檢測各組藥物處理后小鼠B16細胞PTEN蛋白的表達情況
　　 5采用流式細胞分析術，檢測小鼠B16細胞的細胞周期變化和凋

6、亡的發(fā)生
　　 將實驗分為4組，分別為陰性對照組（不加任何藥物）、阿維A組（1.0umol/L）、干擾素組（1000u/ml）、阿維A（1.0umol/L）聯(lián)合干擾素組（1000u/ml）。各組藥物干預48小時后，收集各組別細胞，用流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期分布情況。
　　 6流式細胞儀（FCM）檢測各藥物處理后B16細胞的PTEN蛋白表達情況。
　　 7運用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，采用單因

7、素方差分析，以a=0.05為差異顯著性標準。
　　 結果：
　　 1 MTT比色分析法檢測處理因素對小鼠B16細胞增殖的影響（相對抑制率）
　　 1.1阿維A酸組各組間差別具有顯著性（p<0.05）。不同濃度的阿維A酸對小鼠B16細胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應關系和時間依賴效應關系。
　　 1.2干擾素組各組間差別具有顯著性（p<0.05）。不同濃度的干擾素對小鼠B16細胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依

8、賴效應和時間依賴效應關系。
　　 1.3阿維A聯(lián)合干擾素組將實驗分為4組，分別為陰性對照組（不加任何藥物）、阿維A組（1.0umol/L）、干擾素組（1000u/ml）、阿維A（1.0umol/L）聯(lián)合干擾素組（1000u/ml）。阿維A酸和干擾素聯(lián)合應用可抑制B16細胞增殖，與阿維A酸或干擾素單獨應用比較，差異有顯著性（p<0.05）。金氏公式分析表明阿維A與干擾素聯(lián)合應用對B16細胞有協(xié)同的抑制作用。
　　 2阿維A

9、及干擾素對小鼠B16細胞分化及形態(tài)的影響
　　 陰性對照組細胞呈梭形或多角形，貼壁生長，分布均勻，大小基本一致，增殖旺盛，核固縮現(xiàn)象偶見；阿維A作用細胞24小時后，B16細胞出現(xiàn)生長不佳，細胞皺縮、破裂，有的細胞兩端出現(xiàn)偽足，飄浮細胞增多等現(xiàn)象，隨著阿維A作用時間的延長，上述現(xiàn)象更加明顯；干擾素細胞呈雙極性改變，B16細胞變狹長，脫壁懸浮細胞增多，隨著作用時間延長，上述現(xiàn)象更加明顯；兩者聯(lián)合應用組細胞生長緩慢，細胞數(shù)目減少，脫壁

10、懸浮細胞明顯增多，雙極性細胞明顯可見。
　　 3免疫細胞化學法檢測干擾素及阿維A誘導前后對小鼠B16細胞PTEN表達情況
　　 PTEN蛋白主要表達于細胞漿內，DAB染色呈棕黃色。各組細胞PTEN蛋白陽性表達的程度不同，陰性對照組細胞PTEN表達較弱，呈淺棕黃色；在阿維A組，干擾素組及聯(lián)合用藥組B16細胞中，PTEN的染色程度均有不同程度的增強，差異具有顯著性（p<0.05）。
　　 4流式細胞儀檢測各組藥物處理

11、后細胞的凋亡情況和細胞周期變化
　　 各組藥物均能使G1期延滯，G1-S期轉化抑制，將細胞阻滯于G0/G1期，使S期細胞的比率減少。阿維A與聯(lián)合干擾素應用具有協(xié)同作用，但二者誘導B16細胞凋亡的作用并不顯著。
　　 5流式細胞術檢測各組藥物處理后B16細胞PTEN蛋白的表達情況
　　 與陰性對照組相比，各藥物處理組作用48小時后，表達PTEN的陽性細胞數(shù)升高，阿維A、干擾素和聯(lián)合用藥組作用B16細胞48小時后，P

12、TEN蛋白表達熒光指數(shù)（FI）分別為1.1233、1.2033和1.6300，進一步進行兩兩比較差異也都具有顯著性（p<0.05）。
　　 結論：
　　 1.阿維A酸和干擾素都能抑制B16細胞的增殖，并且在一定的濃度和時間范圍內，二者對B16細胞增殖的抑制率具有量效相關性和時間依賴性。
　　 2.阿維A聯(lián)合干擾素對B16細胞的增殖抑制率優(yōu)于阿維A和干擾素單用，二者聯(lián)合應用具有協(xié)同作用。
　　 3.阿維A酸