黑色素瘤小鼠高轉(zhuǎn)移模型體內(nèi)篩選和細(xì)胞系的建立.pdf

1、目的：采用深度免疫缺陷動(dòng)物，并通過手術(shù)切除腫瘤進(jìn)行高轉(zhuǎn)移模型體內(nèi)綜合篩選的實(shí)驗(yàn)思路，建立鼠源和人源黑色素瘤小鼠高轉(zhuǎn)移模型及相應(yīng)細(xì)胞系，同時(shí)觀察相關(guān)生物學(xué)特性，探討轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)理，為腫瘤的預(yù)防、診斷和治療等提供理想的動(dòng)物模型。 方法：1.小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移模型的體內(nèi)篩選和細(xì)胞系的建立： 將小鼠黑色素瘤B16移植于T、B、NK細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷的BNX小鼠皮下，首先進(jìn)行皮下移植→手術(shù)切除→肺轉(zhuǎn)移→皮下移植的連續(xù)三代體內(nèi)篩選，再按

2、照皮下移植→肺轉(zhuǎn)移→皮下移植的方法繼續(xù)進(jìn)行三代篩選，建立移植性自發(fā)高轉(zhuǎn)移模型，同時(shí)進(jìn)行腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移情況和病理組織學(xué)的觀察。采用組織塊法對(duì)小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移腫瘤組織進(jìn)行原代培養(yǎng)及建立細(xì)胞系，觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)速度、體外侵襲能力、染色體形態(tài)分析、細(xì)胞周期變化、體內(nèi)驗(yàn)證皮下移植的成瘤率和轉(zhuǎn)移情況。 2.人黑色素瘤高轉(zhuǎn)移模型的體內(nèi)篩選及微轉(zhuǎn)移動(dòng)態(tài)檢測(cè)： 利用人黑色素瘤A357細(xì)胞株進(jìn)行SCID小鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)

3、6只動(dòng)物中有1只發(fā)生明顯肺轉(zhuǎn)移，取肺轉(zhuǎn)移灶移植至SCID小鼠皮下擴(kuò)增。采用皮下移植→肺轉(zhuǎn)移→皮下移植體內(nèi)反復(fù)篩選的方法，建立皮下移植小鼠肺高轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型(血路轉(zhuǎn)移合并淋巴道轉(zhuǎn)移)及相應(yīng)的人黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，并進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)特性的初步研究。同時(shí)應(yīng)用該細(xì)胞系建立BNX小鼠皮下移植瘤模型，通過Alu-PCR進(jìn)行動(dòng)態(tài)、定性的肺微轉(zhuǎn)移檢測(cè)。 結(jié)果：1.小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移模型的體內(nèi)篩選和細(xì)胞系的建立： 通過體內(nèi)綜合篩選，成功建立

4、了BNX小鼠B16黑色素瘤皮下移植腫高轉(zhuǎn)移模型。該模型的皮下移植成瘤率可達(dá)100％，35d時(shí)肺轉(zhuǎn)移率達(dá)到91.7％(1l/12)，轉(zhuǎn)移程度達(dá)到+++。同時(shí)建成相應(yīng)的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，將其命名為B16-sci，其倍增時(shí)間為46.07h，自然凋亡率顯著低于B16細(xì)胞(19<0.05)，體外侵襲能力顯著強(qiáng)于B16細(xì)胞(P<0.05)，染色體分析結(jié)果表明B16-sci細(xì)胞符合小鼠惡性腫瘤細(xì)胞染色體的特點(diǎn)。體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果表明，B16-sci細(xì)胞移植于B

5、NX小鼠皮下，已能穩(wěn)定形成100％(6/6)肺轉(zhuǎn)移，同時(shí)提高了該細(xì)胞在C57BL/6J小鼠皮下移植后的肺轉(zhuǎn)移率。 2.人黑色素瘤SCI-375高轉(zhuǎn)移模型的篩選及微轉(zhuǎn)移動(dòng)態(tài)檢測(cè)： 經(jīng)體內(nèi)反復(fù)篩選，成功建立了皮下移植小鼠肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型(血路轉(zhuǎn)移合并淋巴道轉(zhuǎn)移)。潛伏期從篩選初期的7-14天逐漸縮短至5天左右，荷瘤壽命從60—75天下降并穩(wěn)定在45天左右。篩選傳代的243只SCID小鼠，皮下100％成瘤，肺轉(zhuǎn)移率隨著篩選的進(jìn)行

6、，逐代提高，第6代起腫轉(zhuǎn)移率保持在100％。建成了相應(yīng)的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，并將其命名為SCI-375，其倍增時(shí)間為21.60h，體外侵襲能力強(qiáng)于未篩選的A375(P<0.05)，染色體分析結(jié)果顯示該細(xì)胞具有人類惡性腫瘤細(xì)胞染色體的特點(diǎn)。體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果表明：SCI-375在不同免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)均能表達(dá)較高的轉(zhuǎn)移率，BNX小鼠肺轉(zhuǎn)移率為100％(13/13)，裸小鼠肺轉(zhuǎn)移率為90.91％(10/11)。Alu-PCR結(jié)果顯示：2W時(shí)，PCR檢測(cè)和

7、常規(guī)病理檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移均為陰性；3w、4W、5w時(shí)，PCR檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移率分別為(37.5％)3/8、(75％)6/8、(100％)10/10，常規(guī)病理檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移率分別為(0％)0/8、(37.5％)3/8、(50％)5/10?？梢?，分子生物學(xué)的方法可以早期檢測(cè)腫瘤微轉(zhuǎn)移情況的發(fā)生，其靈敏度和高效性要優(yōu)于常規(guī)病理檢測(cè)。 結(jié)論：1.利用深度免疫缺陷動(dòng)物以及手術(shù)切除腫瘤進(jìn)行高轉(zhuǎn)移模型的體內(nèi)篩選的實(shí)驗(yàn)思路，成功建立了一個(gè)肺轉(zhuǎn)移率高、轉(zhuǎn)移特性穩(wěn)