缺氧和血管緊張素Ⅱ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞的損傷與銀杏葉提取物的保護(hù)作用研究.pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)是血管屏障的重要組成部分，可以合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，在調(diào)節(jié)血管收縮舒張功能、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面具有重要意義。VEC功能障礙是多種心血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，也和呼吸、生殖、神經(jīng)內(nèi)分泌、腫瘤及風(fēng)濕性疾病等密切相關(guān)。VEC功能障礙的評(píng)價(jià)方法主要包括循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞檢測(cè)、內(nèi)皮細(xì)胞分泌活性物質(zhì)的測(cè)定、內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和線(xiàn)粒體膜電位的測(cè)定、冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能的檢測(cè)等方法，綜

2、合運(yùn)用上述評(píng)價(jià)方法，有利于探討VEC功能障礙的發(fā)生機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在上述多種疾病的發(fā)生中，VEC既是受損的“靶”細(xì)胞，又是損傷的“激發(fā)”細(xì)胞，因此，從整體、細(xì)胞和分子水平進(jìn)行VEC損傷及保護(hù)性研究是防治多種疾病的重點(diǎn)課題之一。 缺氧是導(dǎo)致VEC損傷的極為常見(jiàn)的病理因素，血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)直接作用于血管床使血

3、管收縮的重要的血管活性肽，Ang II是該系統(tǒng)中最為重要的血管活性物質(zhì)，它行使著循環(huán)內(nèi)分泌系統(tǒng)和組織旁分泌/自分泌系統(tǒng)的功能，Ang II可引起血管內(nèi)皮功能低下。缺氧和Angll在高血壓、動(dòng)脈硬化、心衰和肺動(dòng)脈高壓等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。在現(xiàn)代航天航空活動(dòng)中，因缺氧引起的航空事故及事故征候仍占有相當(dāng)比例，因此，以加強(qiáng)內(nèi)源性抗損傷的醫(yī)療思想為指導(dǎo)，將利用現(xiàn)代技術(shù)提取的副作用較少的植物提取物應(yīng)用于缺氧損傷與保護(hù)作用的研究具有重要意

4、義。 目的：通過(guò)建立VEC缺氧損傷模型，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察缺氧條件下Ang II引起VEC鈣離子濃度及線(xiàn)粒體膜電位(mitochondria membrane potential，MMP)的變化，應(yīng)用放射免疫法測(cè)定在缺氧和Ang II作用后VEC培養(yǎng)液中內(nèi)皮素( endothelin，ET)含量的變化，并觀察銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)對(duì)上述變化的影響，探討GBE對(duì)VEC的保護(hù)作用機(jī)制

5、。 方法： 一、選用人大動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，常規(guī)復(fù)蘇傳代，建立VEC缺氧損傷模型。 二、實(shí)驗(yàn)設(shè)為空白對(duì)照組、缺氧組、缺氧+GBE保護(hù)組、Ang II作用組、Ang II+GBE保護(hù)組、缺氧+Ang II作用組及缺氧+Ang II+GBE保護(hù)組等七組。各組細(xì)胞分別在不同因素作用后，應(yīng)用Fluo-3/AM負(fù)載，用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定VEC內(nèi)Fluo-3的熒光強(qiáng)度值以代表VEC內(nèi)的Ca2+濃度；各組細(xì)胞分別在不同因素作用

6、后，應(yīng)用Rhodamine123(Rh123)負(fù)載，用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定VEC內(nèi)Rh123的熒光強(qiáng)度值以代表VEC內(nèi)的MMP。 三、將培養(yǎng)的VEC按每12孔一組分為上述七組，各組細(xì)胞分別在不同因素作用后，吸取VEC培養(yǎng)上清液，應(yīng)用放射免疫技術(shù)，測(cè)定VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量。 結(jié)果： 一、與對(duì)照組比較，經(jīng)過(guò)缺氧作用后，VEC內(nèi)Ca2+濃度明顯升高(P<0.01)，MMP明顯降低(P<0.01)，VEC培養(yǎng)上清

7、液中的ET含量明顯增加(P<0.001)。 二、與對(duì)照組比較，經(jīng)過(guò)Ang II作用后，VEC內(nèi)Ca2+濃度明顯升高(P<0.01)，MMP明顯降低(P<0.01)，VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量明顯增加(P<0.001)。 三、與對(duì)照組比較，缺氧與Ang II聯(lián)合作用后，VEC內(nèi)Ca2+濃度明顯升高(P<0.01)，MMP明顯降低(P<0.01)，VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量明顯增加(P<0.001)，且比單純?nèi)毖踝饔眉皢?/p>

8、純Ang II作用的影響顯著(P<0.05)。 四、與相應(yīng)的損傷組比較，GBE保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯降低(P<0.01)，MMP明顯升高(P<0.05)，VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量明顯下降(P<0.001)。 五、與對(duì)照組比較，各GBE保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、MMP以及VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量均未恢復(fù)至對(duì)照組水平，差異有顯著意義(P<0.05)。 討論： 一、缺氧對(duì)VEC內(nèi)Ca2+濃度、MM

9、P和培養(yǎng)上清液中ET含量的影響：Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)信使，參與各種調(diào)控細(xì)胞功能的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，Ca2+超載是許多原因引起細(xì)胞損害的“最后共同通路”。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度由ATP酶依賴(lài)性鈣泵、Na+/ Ca2+交換以及正常Ca2+通道調(diào)控。缺氧導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化功能抑制，細(xì)胞內(nèi)ATP含量快速下降，鈉鉀泵功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化而引起電壓依賴(lài)型Ca2+通道開(kāi)放，Ca2+內(nèi)流；同時(shí)，缺氧使氧自由基清除系統(tǒng)功能降低或喪失，而生成系統(tǒng)卻活性增強(qiáng)，氧

10、自由基大量產(chǎn)生與急劇“堆積”，作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體等鈣庫(kù)，促進(jìn)Ca2+超載.細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載觸發(fā)線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial permeability transition pore，MPT)的開(kāi)放，導(dǎo)致MMP下降；缺氧促進(jìn)機(jī)體活性氧生成，活性氧生成過(guò)多可直接或間接損傷線(xiàn)粒體膜，造成MMP下降。VEC內(nèi)氧自由基含量的增加以及脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，導(dǎo)致VEC分泌ET的功能增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次驗(yàn)證了缺氧可導(dǎo)致VEC內(nèi)Ca

11、2+濃度升高、MMP下降及VEC分泌ET增多。 二、Ang II對(duì)VEC內(nèi)Ca2+濃度、MMP和培養(yǎng)上清液中ET含量的影響：生理情況下，低濃度的Ang II能維持血管的構(gòu)造和張力；在病理情況下Ang II的濃度升高，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究觀察到Ang II可引起VEC內(nèi)Ca2+濃度升高、MMP下降和培養(yǎng)上清液中ET含量升高，造成了VEC的損傷。其機(jī)制可能為Ang II作用于VEC的血管緊張素II1型受體(AT1)，使4，5-

12、二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸肌醇(IP3)增多，IP3可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放；Ang II能夠抑制VEC鈣激活鉀通道的作用，使VEC膜上的Na+-K+ATP酶活性降低，Na+- K+泵功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化而引起電壓依賴(lài)型Ca2+通道開(kāi)放，Ca2+內(nèi)流；Ang II導(dǎo)致的VEC內(nèi)鈣超載以及氧化應(yīng)激，均可造成MMP的下降；Ang II刺激VEC內(nèi)皮素前體的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)ET的分泌。 三、缺氧聯(lián)合Ang II對(duì)VEC內(nèi)Ca2+

13、濃度、MMP和培養(yǎng)上清液中ET含量的影響：既往的研究大都是將缺氧與Ang II分別單獨(dú)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞后，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、MMP及培養(yǎng)上清中ET含量的變化，以評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，本研究將缺氧與Ang II聯(lián)合作用于VEC，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合作用與單純?nèi)毖趸駻ng II作用比較，VEC內(nèi)Ca2+濃度升高、MMP下降和培養(yǎng)上清液中ET含量增加均更加顯著，提示缺氧與Ang II對(duì)VEC的損傷有協(xié)同作用。其原因可能為缺氧比Ang

14、 II導(dǎo)致的VEC氧化應(yīng)激損傷更強(qiáng)烈，而Ang II除具有導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷外，還能作用于AT1受體，進(jìn)一步通過(guò)IP3途徑造成VEC的損傷?？梢哉f(shuō)Ang II加強(qiáng)了缺氧對(duì)VEC的損傷作用，從而使VEC的損傷較單純?nèi)毖踝饔眉皢渭傾ng II作用加重。 四、銀杏葉提取物對(duì)VEC內(nèi)Ca2+濃度、MMP和培養(yǎng)上清液中ET含量的影響：細(xì)胞內(nèi)Ca2+集聚是細(xì)胞不可逆性損傷過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，而VEC損傷后發(fā)生的功能改變則是導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的

15、重要因素，因此，避免或減輕VEC氧化應(yīng)激損傷以及防止和減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+集聚是防治細(xì)胞不可逆損傷的重要環(huán)節(jié)。GBE既能清除自由基、提高抗氧化酶活性，保證線(xiàn)粒體膜的穩(wěn)定性，又能對(duì)抗Ang II抑制VEC的鈣激活鉀通道作用，最終可能激活VEC膜上的Na+-K+酶的活性，降低Ca2+通道的活性，阻止Ca2+內(nèi)流及肌漿網(wǎng)Ca2+的釋放，從而顯示出鈣通道阻滯劑的作用而有效抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，避免MPT的開(kāi)放，穩(wěn)定MMP，也最終阻斷ET mRNA

16、的過(guò)多表達(dá)，達(dá)到降低ET水平的結(jié)果，表現(xiàn)出細(xì)胞保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明GBE確實(shí)能減輕損傷所致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高、MMP下降及ET分泌量增加的程度，提示其對(duì)缺氧和Ang II引起VEC損傷具有保護(hù)作用。但這種保護(hù)作用是不完全的，原因可能為GBE發(fā)揮的生物活性作用主要是抗氧化作用，不是完全的Ca2+通道阻滯劑，僅能部分阻滯胞外Ca2+內(nèi)流；對(duì)激活Ca2+泵的作用有限；不能完全抑制內(nèi)儲(chǔ)鈣的釋放；其藥理作用的發(fā)揮可能存在時(shí)-效和量-效關(guān)

17、系，因此，GBE對(duì)VEC的保護(hù)作用是有限的。提示聯(lián)合應(yīng)用VEC保護(hù)藥物及選擇合適的藥物濃度是今后研究的重點(diǎn)。 結(jié)論： 1.缺氧及Ang II可損傷VEC，導(dǎo)致Ca2+濃度升高、MMP下降和ET分泌量增加。 2.缺氧與Ang II聯(lián)合作用可使VEC內(nèi)Ca2+濃度升高、MMP下降和ET分泌量增加均更加顯著，表明二者對(duì)VEC的損傷具有協(xié)同作用，提示在機(jī)體缺氧損傷過(guò)程中產(chǎn)生的Angll可加強(qiáng)缺氧對(duì)VEC的損害。