銀杏葉提取物對人牙周膜細(xì)胞保護(hù)作用的初步研究.pdf

1、銀杏葉為銀杏的干燥葉,其提取物(Ginkgobilobaextract,GBE)及制劑廣泛應(yīng)用于臨床,具有改善微循環(huán)、擴(kuò)張心腦血管、抗氧化、清除和抑制氧自由基、抗菌消炎、抗病毒等藥理作用。隨著藥理作用機(jī)制的深入研究和藥物提取工藝標(biāo)準(zhǔn)化的提出,銀杏葉的藥用價值在農(nóng)藥、獸藥和醫(yī)藥等多方面得已體現(xiàn),在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中也得到越來越廣泛的應(yīng)用,但其對牙周病的治療機(jī)理尚不明確。人牙周膜細(xì)胞(Pcriodentalligamentcells,PDLCs

2、)作為牙周組織中的主要功能細(xì)胞,具有多向分化潛能,在牙周組織再生修復(fù)中發(fā)揮重要作用。
　　 目的:通過觀察GBE對體外培養(yǎng)人PDLCs增殖及其細(xì)胞周期的影響以及脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)介導(dǎo)下GBE對人PDLCs分泌細(xì)胞因子的影響。從細(xì)胞水平證實GBE對人PDLCs的保護(hù)作用,并初步探討GBE在牙周病治療中的作用機(jī)理,為GBE在牙周病治療方面的應(yīng)用提供實驗與理論基礎(chǔ)。
　　 方法:本研究分三個

3、部分
　　 實驗一改良組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞及其生物學(xué)特性觀察。
　　 采用改良組織塊培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)PDLCs。常規(guī)蘇木精-伊紅(Haematoxylin-eosinestain,HE)染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,采用免疫組織化學(xué)鑒定法鑒定細(xì)胞來源。
　　 實驗二銀杏葉提取物對人牙周膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。
　　 1.噻唑藍(lán)(methylthiazoliltetracolium,MTT)比色法測定

4、GBE對人PDLCs增殖的影響。取4-7代人PDLCs,用0.25％胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后,按實驗分組分別加入含10％胎牛血清(Fetalbovingserum,FBS)及不同濃度GBE的DMEM培養(yǎng)液(Dulbeccominimalessentialmedium,DMEM)(含GBE濃度分別為1、0.1、0.01、0.001mg/ml),對照組為只含10％FBS的D

5、MEM,每組4復(fù)孔。分別培養(yǎng)12、24、48、72h后進(jìn)行MTT檢測。
　　 2.流式細(xì)胞儀(FlowCytometry,FCM)測定GBE對人PDLCs細(xì)胞周期的影響,按實驗分組分別加入含10％FBS及不同濃度的GBE的DMEM(含GBE濃度分別為0.1、0.01mg/ml),對照組為只含10％FBS的DMEM,分別培養(yǎng)12、24、48、72h后將待測細(xì)胞離心-PBS沖洗-固定-離心-沖洗-染色后上機(jī)檢測,用細(xì)胞增殖指數(shù)(Pr

6、oliferationindex,PrI)表示相對增殖能力。
　　 實驗三銀杏葉提取物對脂多糖介導(dǎo)下人牙周膜細(xì)胞生長及分泌細(xì)胞因子的影響。
　　 1.觀察不同濃度GBE對LPS介導(dǎo)下PDLCs活性的影響。取生長狀態(tài)良好的第5代人PDLCs,實驗分為五組:對照組、LPS組、LPS+0.1mg/mlGBE組、LPS+0.01mg/mlGBE組、LPS+地塞米松組。對照組為僅含10％FBS的DMEM,LPS終濃度為100μg/

7、ml,地塞米松終濃度為2μg/ml,分別培養(yǎng)12、24、48、72h后,應(yīng)用MTT比色法測定各組光密度(Opticaldensity,OD)。
　　 2.觀察不同濃度GBE對LPS介導(dǎo)下PDLCs分泌白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(Tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)水平的影響。取生長狀態(tài)良好的第5代人PD

8、LCs,實驗分為五組:對照組、LPS組、LPS+0.1mg/mlGBE組、LPS+0.01mg/mlGBE組、LPS+地塞米松組。對照組為僅含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液,LPS終濃度為100μg/ml,地塞米松終濃度為2μg/ml,分別培養(yǎng)12、24、48、72h后取培養(yǎng)細(xì)胞的上清液,保存于-20℃冰箱待檢,按酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzymelinkedimmunosorbentassay,EuSA)檢測試劑盒操作步驟,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值

9、所得標(biāo)準(zhǔn)曲線,換算所測上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代培養(yǎng)的牙周膜組織塊周圍7天左右可見有梭形細(xì)胞游出。經(jīng)免疫組化鑒定:抗細(xì)胞角蛋白陰性,抗波形絲蛋白陽性。
　　 2.①MTT結(jié)果表明:1mg/mlGBE組對人PDLCs有一定的抑制作用,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),0.1mg/mlGBE組在12、24、48h對人PDLCs有促進(jìn)增殖作用,與對照組比較

10、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),0.01mg/mlGBE組在24、48、72h對人PDLCs有促進(jìn)增殖作用,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),0.001mg/ml組對人PDLCs促進(jìn)作用不明顯,與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。②FCM結(jié)果表明:0.1mg/mlGBE組在12、24、48hPrI與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),0.01mg/mlGBE組在24、48、72hPrI與對照組比較差異有統(tǒng)

11、計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.①MTT結(jié)果表明:LPS在濃度為100μg/ml時明顯抑制細(xì)胞活性,與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),加入0.1、0.01mg/mlGBE后細(xì)胞活性明顯增強,與LPS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。②ELISA結(jié)果表明:LPS在濃度為100μg/ml時明顯促進(jìn)人PDLCs分泌IL-6、IL-1β、TNF-α的水平,與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),加入

12、0.1、0.01mg/mlGBE均能抑制LPS介導(dǎo)下人PDLCs分泌IL-6、IL-1β、TNF-α的活性,與LPS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.利用改良組織塊培養(yǎng)法所培養(yǎng)細(xì)胞為來源于中胚層的細(xì)胞,而非上皮源性。證明本實驗成功培養(yǎng)了人PDLCs,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　 2.①不同濃度的GBE對人PDLCs增殖影響不同,1mg/mlGBE抑制人PDLCs增殖,0.1、0.01

13、mg/mlGBE促進(jìn)人PDLCs增殖并呈濃度依賴性。②0.1、0.01mg/mlGBE促進(jìn)體外培養(yǎng)人PDLCs增殖時,使G1期細(xì)胞減少,S期細(xì)胞增加,細(xì)胞增殖指數(shù)PrI值(S+G2/M)％增高,促進(jìn)更多的細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)。
　　 3.GBE對LPS抑制人PDLCs活性具有保護(hù)作用,并且能抑制LPS介導(dǎo)人PDLCs分泌TNF-α、IL-6、IL-1β水平,提示GBE在抗炎作用方面的作用機(jī)制與抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎