廣州管圓線蟲病防治的相關(guān)基礎(chǔ)研究及鉤端螺旋體病DNA疫苗的研究.pdf

1、廣州管圓線蟲病是一種自然疫源性疾病，其病原體為廣州管圓線蟲，該病已被衛(wèi)生部列為新發(fā)傳染病之一。人為該蟲的非適宜宿主，常因生食、半生食含有Ⅲ期活幼蟲的淡水螺肉而感染。幼蟲侵入人體后主要移行到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起以嗜酸粒細(xì)胞浸潤為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，造成對(duì)神經(jīng)元的損傷，其病變多累及大腦、小腦、腦干、脊髓等，腦脊液中嗜酸粒細(xì)胞增高明顯，故稱為嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎。感染嚴(yán)重時(shí)致患者死亡或留下后遺癥。我國臺(tái)灣、廣東、廣西、云南、福建、浙

2、江、海南、湖南及江西先后報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病的自然疫源地。近年來，浙江、福建、云南及北京先后出現(xiàn)該病的群體爆發(fā)事件。廣州管圓線蟲病的擴(kuò)散與流行是我國公共衛(wèi)生面臨的新問題。由于中間宿主福壽螺及褐云瑪瑙螺的大量養(yǎng)殖與食用，加上氣候變暖，導(dǎo)致該病的向北擴(kuò)散，防治難度加大。該病發(fā)生與飲食習(xí)慣有關(guān)，常發(fā)生爆發(fā)事件，且感染后主要造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，危害嚴(yán)重。目前對(duì)該病的研究尚不系統(tǒng)和深入，為此有必要進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)基礎(chǔ)研究工作，為關(guān)鍵防治技術(shù)的研制應(yīng)用提

3、供理論支撐和新思路。 嗜酸粒細(xì)胞活性產(chǎn)物如ECP具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，嗜酸粒細(xì)胞活性產(chǎn)物可能為該病的致病因素。嗜酸粒細(xì)胞活化因子除IL5已見報(bào)道之外，其它活化因子如C5a及LTB4尚未見報(bào)道。C5a及LTB4同時(shí)也是重要的炎癥因子。因此有必要進(jìn)一步開展嗜酸粒細(xì)胞活性產(chǎn)物及活化因子的研究，有助于進(jìn)一步了解該病的發(fā)病機(jī)制。如何預(yù)防蟲體殺死后其蟲體組分在腦部引起的超敏反應(yīng)是廣州管圓線蟲病治療過程中需要解決的問題，目前有采用抗寄生蟲藥物與

4、激素類藥物聯(lián)合用藥的方案，但激素類藥物存在許多副作用，尋找替代藥物是目前的研究熱點(diǎn)。本課題在國家“863”項(xiàng)目基金的資助下，開展了廣州管圓線蟲遺傳多態(tài)性及其對(duì)不同宿主的易感性研究，感染小鼠嗜酸粒細(xì)胞活化相關(guān)因子的檢測(cè)，阿苯達(dá)唑聯(lián)合黃芩素對(duì)廣州管圓線蟲病治療效果的實(shí)驗(yàn)研究。 第1章廣州管圓線蟲的生物學(xué)特性研究 目的： 分析來源于不同地理環(huán)境的廣州管園線蟲株的CO1和ITS2基因以及PCR—ISSR的多態(tài)性，了解廣州

5、管圓線蟲的遺傳多態(tài)性。比較廣州管圓線蟲廣州株在中間宿主褐云瑪瑙螺和福壽螺螺體內(nèi)的發(fā)育情況及對(duì)非適宜宿主BALB/c小鼠和昆明小鼠的毒力，為建立實(shí)驗(yàn)室廣州管圓線蟲生態(tài)系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型提供依據(jù)。 方法： 從?？?、南寧、廣州、福州及溫州采集褐云瑪瑙螺或福壽螺，從中分離幼蟲感染鼠類后收集蟲體或直接從家鼠中分離成蟲。采用PCR擴(kuò)增CO1及ITS2的DNA片段，T—A克隆后測(cè)序，序列對(duì)齊分析、構(gòu)建遺傳樹，并進(jìn)行SSCP分析。同時(shí)進(jìn)

6、行PCR—ISSR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳直接進(jìn)行分析不同地區(qū)來源的廣州管圓線蟲是否存在基因多態(tài)性。同時(shí)，連續(xù)7d分別用感染大鼠的糞便喂食實(shí)驗(yàn)室傳代的福壽螺和褐云瑪瑙螺，1個(gè)月后解剖感染螺，觀察螺體內(nèi)廣州管圓線蟲幼蟲的發(fā)育及蟲數(shù)；從褐云瑪瑙螺和福壽螺分離廣州管圓線蟲Ⅲ期幼蟲(L3)分別感染昆明鼠；而感染BALB/c小鼠的Ⅲ期幼蟲來自于褐云瑪瑙螺。通過觀察感染小鼠的死亡率、體重變化、MMP—9活性、腦組織的病理變化、腦內(nèi)蟲體數(shù)及腦脊液總蛋

7、白含量等指標(biāo)評(píng)價(jià)不同宿主來源幼蟲的致病力。 結(jié)果與分析： 來自同一地區(qū)的廣州管園線蟲蟲株CO1及ITS2序列一致，PCR—ISSR條帶相同。廣州、南寧及福州來源的蟲株ITS2序列一致。溫州蟲株ITS2與前三者相差2個(gè)堿基，遺傳距離為0.00791。海口蟲株與廣州株相差1個(gè)堿基，遺傳距離為0.00395。中國大陸蟲株與菲律賓蟲株相比相差1～2個(gè)堿基，遺傳距離為0.00797及0.00396。中國大陸蟲株與日本蟲株相比相差3

8、～6個(gè)堿基，遺傳距離最遠(yuǎn)。用系統(tǒng)發(fā)育的方法分析可將其分為5支：廣州、南寧及福州來源的蟲株為1支，?？趤碓聪x株為1支，溫州來源的蟲株為1支，菲律賓蟲株為1支，日本蟲株為1支。廣州、南寧及福州蟲株CO1序列一致，溫州蟲株與?？谙x株顯示出差異，廣州株與溫州株的遺傳距離為0.03315，廣州株與海口株的遺傳距離為0.01652，溫州株與?？谥甑倪z傳距離為0.1381。用系統(tǒng)發(fā)育的方法分析15個(gè)CO1序列，可將其分為3支：廣州、南寧及福州的蟲株為

9、1支，?？谙x株及溫州蟲株各為1支。PCR—ISSR的帶型可分為3種，與CO1分支一致。幼蟲在褐云瑪瑙螺及福壽螺中的發(fā)育無顯著性差異，但褐云瑪瑙螺感染的幼蟲數(shù)量高于福壽螺。BALB/c小鼠感染廣州管圓線蟲后其死亡率、MMP—9活性、腦內(nèi)蟲體數(shù)及腦脊液總蛋白含量等明顯高于昆明小鼠，其體重減輕、病理變化也更明顯。用不同螺來源的Ⅲ期幼蟲感染的昆明小鼠其MMP—9活性、腦內(nèi)蟲體數(shù)、腦脊液總蛋白含量、體重減輕及腦組織病變程度均無顯著差異。

10、結(jié)論： 根據(jù)廣州管圓線蟲CO1及ITS2基因序列以及PCR—ISSR結(jié)果提示廣州管圓線蟲存在基因多態(tài)性。我國的廣州管圓線蟲至少存在3個(gè)地理株，即廣州株、?？谥旰蜏刂葜?。同一地區(qū)不同宿主來源的廣州管圓線蟲的遺傳背景一致。褐云瑪瑙螺與福壽螺對(duì)廣州管圓線蟲均易感，且不同宿主來源的廣州管圓線蟲Ⅲ期幼蟲對(duì)昆明小鼠的毒力無差異。BALB/c小鼠感染后，其病理變化比昆明小鼠更明顯，提示其更適合作為廣州管圓線蟲病的動(dòng)物模型。 第2章廣州

11、管圓線蟲所致嗜酸性腦炎的相關(guān)機(jī)制研究 目的： 分析Eotaxin、C5a、LTB4及嗜酸粒細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞活性產(chǎn)物ECP的關(guān)系，深化廣州管圓線蟲致嗜酸粒細(xì)胞活化的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。評(píng)價(jià)黃芩素聯(lián)合阿苯達(dá)唑?qū)π∈髲V州管圓線蟲病的治療效果，觀察黃芩素能否下調(diào)嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量及Eotaxin水平，為優(yōu)化廣州管圓線蟲病的治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 收集不同感染時(shí)期的小鼠血清和腦脊液；Western blot定性檢測(cè)

12、C5a，ELISA定量檢測(cè)C5a；采用ELISA測(cè)定LTB4和ECP的水平；計(jì)數(shù)腦脊液中淋巴細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞；統(tǒng)計(jì)分析這些指標(biāo)在感染小鼠與對(duì)照小鼠之間以及感染小鼠不同時(shí)期之間的差別，并分析Eotaxin、C5a、LTB4及嗜酸粒細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞活性產(chǎn)物ECP的關(guān)聯(lián)性。建立小鼠(BABL/C)感染模型，在小鼠感染后5d或15d給予黃芩素與阿苯達(dá)唑的聯(lián)合用藥治療，同時(shí)設(shè)藥物單用、感染對(duì)照及健康對(duì)照組。通過小鼠生存率(生存時(shí)間)、體重變化、神

13、經(jīng)功能評(píng)分變化等指標(biāo)的比較，以及小鼠腦脊液中MMP—9活性、Eotaxin水平、總蛋白含量、淋巴細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)，評(píng)價(jià)治療效果。 結(jié)果與分析： 感染小鼠血清及腦脊液中C5a、Eotaxin、嗜酸粒細(xì)胞和ECP均顯著高于對(duì)照組小鼠。腦脊液中ECP與C5a在感染后16d達(dá)高峰。C5a、Eotaxin、嗜酸粒細(xì)胞均與ECP成正比。腦脊液中LTB4未見顯著增高，與ECP無相關(guān)性。單用阿苯達(dá)唑的療效與治療時(shí)間密切相關(guān)，早

14、期治療或聯(lián)合治療可改善小鼠體重及神經(jīng)功能，死亡率也低于晚期治療，并可減少蟲荷，下調(diào)Eotaxin水平、MMP—9活性、總蛋白含量、淋巴細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量。但單用黃芩素也可下調(diào)嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量及Eotaxin水平。而阿苯達(dá)唑聯(lián)合黃芩素則無論是早期還是晚期均顯示出良好的療效。聯(lián)合用藥小鼠體重及神經(jīng)功能明顯改善，相對(duì)于晚期單用阿苯達(dá)唑治療組其生存時(shí)間也明顯延長。嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量及Eotaxin水平也出現(xiàn)了明顯下調(diào)。 結(jié)論： 感染

15、廣州管圓線蟲小鼠的腦脊液中存在高水平的嗜酸粒細(xì)胞的活化產(chǎn)物ECP及其活化因子C5a。ECP與嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量及Eotaxin成正比。黃芩素能下調(diào)廣州管圓線蟲感染小鼠腦脊液中的嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量及Eotaxin，可能是阿苯達(dá)唑聯(lián)合黃芩素較單用阿苯達(dá)唑的療效更佳的主要原因。 鉤體病是廣泛傳播的自然疫源性疾病。人類常通過接觸疫水或被污染土壤而感染。感染后可導(dǎo)致肝、腎、肺及腦等多器官損害，危害嚴(yán)重。目前使用的滅活全菌疫苗可保護(hù)機(jī)體抵抗一些常見

16、鉤體型別的感染，但作用短暫且缺乏交叉保護(hù)作用。 研究目的： 觀察pcDNA3.1(+)-lipL21在豚鼠體內(nèi)所產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，評(píng)價(jià)其對(duì)豚鼠抗賴型鉤體的免疫保護(hù)作用，為研制新型鉤體疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法： 從賴型鉤體56601株中擴(kuò)增出全長lipL21基因，亞克隆入pcDNA3.1(+)，構(gòu)建pcDNA3.1(+)—lipL21重組質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染Cos—7細(xì)胞，用免疫組化及West

17、ern Blot分析鑒定lipL21在細(xì)胞中的表達(dá)。用pcDNA3.1(+)—lipL21免疫豚鼠。末次免疫2w后，一半豚鼠被處死后分離豚鼠脾臟淋巴細(xì)胞，通過淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)探測(cè)其活化能力。顯微鏡凝集試驗(yàn)(MAT法)定量檢測(cè)特異性抗體水平。另一半豚鼠以56601株鉤體從腹腔攻擊。比較豚鼠的臨床癥狀。肺、肝、腎做病理切片觀察病理變化，評(píng)價(jià)pcDNA3.1(+)—lipL21對(duì)豚鼠的免疫保護(hù)效果。 結(jié)果與分析： 成功構(gòu)建了真