鉤端螺旋體腺苷甲硫氨酸依賴型氧甲基化酶和人線粒體外膜蛋白mitoNEET的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、第一部分鉤端螺旋體腺苷甲硫氨酸依賴型氧甲基化酶的晶體學(xué)研究 對(duì)所有的生物而言，甲基化是一個(gè)重要而又普遍存在的生物學(xué)過(guò)程。絕大部分的甲基化酶采用腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，甲基化完成后腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為腺苷高胱氨酸。在致病性細(xì)菌問(wèn)號(hào)型鉤端螺旋體全基因組測(cè)序完成后，基因LA0415的產(chǎn)物被注釋為腺苷甲硫氨酸依賴型氧甲基化酶(LiOMT)。經(jīng)序列分析LiOMT被歸為Methyltransf_3蛋白家族(Pfam PF01593)，在這個(gè)

2、家族中細(xì)菌來(lái)源的所有已知功能的5個(gè)甲基化酶均被報(bào)道參與抗生素合成。我們用大腸桿菌大量表達(dá)了LiOMT并得到晶體。在晶體結(jié)構(gòu)中LiOMT結(jié)合有腺苷高胱氨酸配基，展示出非常保守的腺苷甲硫氨酸(腺苷高胱氨酸)結(jié)合區(qū)域和獨(dú)特的金屬離子依賴的催化區(qū)域。LiOMT分子通過(guò)N端的交換形成同二聚體，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道這種二聚的形式能夠在沒(méi)有底物結(jié)合的情況下促進(jìn)底物結(jié)合區(qū)預(yù)折疊。LiOMT的催化區(qū)域和底物結(jié)合區(qū)域的一級(jí)序列和三維結(jié)構(gòu)預(yù)示它的底物是一種酚類化合物，

3、這種酚類化合物可能帶有一個(gè)大環(huán)形狀的尾巴。這是Methyltransf_3家族中的第一個(gè)細(xì)菌來(lái)源的結(jié)構(gòu)，LiOMT晶體結(jié)構(gòu)也給這個(gè)家族中其他細(xì)菌來(lái)源的抗生素合成相關(guān)蛋白提供了可供參考的結(jié)構(gòu)信息。 第二部分人線粒體外膜蛋白mitoNEET的晶體學(xué)研究 mitoNEET是新近被發(fā)現(xiàn)的線粒體外膜蛋白，它能夠特異性結(jié)合抗Ⅱ型糖尿病的藥物吡格列酮。我們對(duì)mitoNEET的細(xì)胞質(zhì)可溶部分(mitoNEET<,33-108>)進(jìn)行了結(jié)

4、構(gòu)解析。mitoNEET<,33-108>擁有一個(gè)全新的折疊類型，并含有一個(gè)[2Fe-2S]鐵硫中心。這個(gè)鐵硫中心與mitoNEET<,33-108>的Cys72，Cys74，Cys83和His87配位，相對(duì)于已知的4個(gè)Cys配位和2個(gè)Cys、2個(gè)His配位的[2Fe-2S]鐵硫中心來(lái)說(shuō)，這種3個(gè)Cys、1個(gè)His的配位類型也是在自然界中第一次發(fā)現(xiàn)。mitoNEET<,33-108>在溶液中和在晶體結(jié)構(gòu)中都形成同二聚體，兩個(gè)單體通過(guò)界面

5、間的疏水相互作用以及兩個(gè)水分子介導(dǎo)的氫鍵相互作用結(jié)合在一起。與[2Fe-2S]鐵硫中心配位的His-87暴露在二體的表面，對(duì)鐵硫中心的功能起著重要作用。我們推測(cè)mitoNEET在線粒體外膜上形成二體，并通過(guò)二體表面上靠近[2Fe-2S]鐵硫中心的區(qū)域與其它蛋白相互作用。 第三部分大腸桿菌膜蛋白二酯酰甘油激酶的初步晶體學(xué)研究 大腸桿菌膜蛋白二酯酰甘油激酶(DAGK)是一個(gè)分子量為13 kDa的小蛋白，它能催化脂分子二酯酰甘

6、油(DAG)和MgATP磷酸化反應(yīng)生成另一種脂分子卵磷脂(PA)和MgADP。它在膜上形成三體，每個(gè)單體三次跨膜，很可能三個(gè)單體共同參與磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)。大腸桿菌DAGK代表了一類微生物DAGK，它們與其它所有已知的DAGK都沒(méi)有序列同源性，卻和其它DAGK一樣催化復(fù)雜的磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)。得到大腸桿菌的晶體結(jié)構(gòu)有利于我們了解這類獨(dú)特的激酶的分子機(jī)理。我們對(duì)DAGK進(jìn)行了表達(dá)、純化和晶體篩選，目前已經(jīng)得到可以衍射的晶體，衍射分辨率為20 A的衍射