VEGFA基因變化在先天性左室流出道梗阻發(fā)生中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：左室流出道梗阻(LVOTO)是一類常見的先天性心臟病(先心病),占先心病發(fā)病總數(shù)的10％～14％。LVOTO包括從解剖左心室流出道一直延伸到降主動脈弓的一組狹窄性病變,包括主動脈瓣狹窄(AVS)、二葉式主動脈瓣(BAV)、主動脈縮窄(CoA)、主動脈弓中斷(IAA)和左心發(fā)育不良綜合征等。LVOTO病變可孤立發(fā)生,也可合并發(fā)生,如BAV常常合并CoA、IAA。先天性主動脈瓣病變和主動脈病變在發(fā)病上的密切聯(lián)系提示二者具有共

2、同的發(fā)生機制。LVOTO可呈家族聚集性發(fā)病,提示遺傳因素參與其發(fā)生。迄今已明確NOTCH1基因突變不僅與家族性和散發(fā)性BAV的發(fā)生有關(guān),而且與LVOTO疾病譜有關(guān),證實了AVS、BAV、CoA和左心發(fā)育不良綜合征在分子水平上具有共同的發(fā)生機制。然而有學者基于分離分析和相對危險度分析認為LVOTO以寡基因遺傳的可能性最大。
　　 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號系統(tǒng)在胚胎心內(nèi)膜墊發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。心內(nèi)膜內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)

3、化是心內(nèi)膜墊形成的基礎(chǔ),而心內(nèi)膜墊是心臟瓣膜形成的原基(primordia)。研究表明,VEGFA和Notch1在調(diào)節(jié)生后心臟瓣膜內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮相反作用。此外,VEGF基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與先天性瓣膜間隔缺損以及心內(nèi)膜墊缺損發(fā)生有關(guān)?；谝陨?我們推測VEGFA(基因座6p12)可能是BAV潛在的候選基因。另一方面,VEGF信號系統(tǒng)在胚胎微血管發(fā)生和血管發(fā)生中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用。VEGF164亞型敲出或表達

4、降低的小鼠和斑馬魚其主動脈弓缺損的發(fā)生危險增加,提示VEGFA可能與人類先天性主動脈弓缺損發(fā)生有關(guān)。
　　 基于以上BAV和其他LVOTO病變在臨床和遺傳學上的緊密重疊性,我們進一步推測VEGFA可能是先天性LVOTO疾病譜潛在的候選基因。然而迄今有關(guān)VEGFA基因變化在先天性LVOTO病變發(fā)生中的作用尚未見報道。為此,本課題對此進行了初步研究。方法我們對192例先天性非綜合征LVOTO患兒和300名正常對照VEGFA基因進行了

5、測序分析。另外基于以下2個因為納入103例圓錐動脈干畸形(法洛四聯(lián)癥75例、右心室雙出口21例,完全性大動脈轉(zhuǎn)位7例)作為疾病對照:(1)圓錐動脈干畸形和LVOTO屬于不同類型的先心?。?2)有報道VEGF基因變化與非綜合征法洛四聯(lián)癥發(fā)病危險無關(guān)。所有病例和對照均為漢族,年齡均小于16歲。對有基因變化的患兒進行家系調(diào)查,包括家系成員經(jīng)胸超聲心動圖篩查和VEGFA基因相應外顯子測序分析。
　　 結(jié)果：192例LVOTO病變多數(shù)相互

6、合并發(fā)生,其中AVS80例,BAV74例,CoA92例,IAA21例。我們在192例LVOTO中發(fā)現(xiàn)10例患兒有7種VEGFA堿基變化,除c.973C>T(p.Arg325X)在NCBI SNP數(shù)據(jù)庫中被提交為編碼SNP(rs45533131),其余堿基變化均未見報道。第5內(nèi)含子區(qū)缺失突變(Intron5-49delC)2例,該內(nèi)含子突變對VEGFA蛋白質(zhì)翻譯沒有影響,為非致病性突變。編碼外顯子區(qū)突變4例,突變率為2.1％(4/192)

7、。C.454C>T(p.Arg152X)無義突變和c.19_22dupGACA(p.Thr8ArgfsX78)內(nèi)部串聯(lián)重復突變不僅通過各自提前產(chǎn)生的終止密碼子導致CUG499翻譯的大VEGF(L-VEGF)蛋白質(zhì)截短,而且由于改變了VEGFmRNA AUG10395’端的總體結(jié)構(gòu)可能影響AUG1039 VEGF的正確翻譯。C.973C>T(p.Arg325X)雖然被提交為編碼SNP,但是尚未獲得證實,而且該SNP提交時其臨床相關(guān)性未知。

8、本研究中所有對照均未發(fā)現(xiàn)c.973C>T基因變化,我們認為其可能為無義突變。C.973C>T無義突變通過提前產(chǎn)生的終止密碼子導致L-VEGF和VEGF蛋白質(zhì)截短。研究表明,L-VEGF是具有生物學活性的VEGF的前體產(chǎn)物,50％具有生物學活性的VEGF來自L-VEGF。因此VEGFA基因劑量不足可能是先天性LVOTO的發(fā)生機制之一。C.998G>A.為雜合錯義突變,導致VEGFA蛋白質(zhì)333位高度保守的精氨酸為谷氨酰胺取代(p.Arg3

9、33Gln)。精氨酸為堿性氨基酸,谷氨酰胺為極性中性氨基酸,二者屬于不同類的氨基酸,氨基酸的這種變化可能影響VEGFA蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。上述4例先證者家系成員經(jīng)胸超聲心動圖篩查雖然均未發(fā)現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)異常,但是測序分析顯示上述4種突變在4個家系中均遺傳了2至3代,表型不完全外顯。VEGFA突變在c.454C>T、c.998G>A.和c.19_22dupGACA突變先證者家系中的平均外顯率為33.3％。3例患兒存在非同義c.1039G>A.

10、(p.Val347Ile)雜合型SNP,1例患兒存在相同位點的純合型SNP。BAV1039A等位基因頻率顯著高于正常對照組(P=0.017),提示c.1039G>A SNP是BAV的發(fā)生危險因素(比值比,8.306；95％可信區(qū)間,1.507-45.788),VEGFA1039A為BAV發(fā)生的易感等位基因。家系調(diào)查結(jié)果顯示c.1039G>A雜合型SNP具有遺傳性。C.454C>T無義突變患兒和1例c.1039G>A雜合型SNP患兒同時有

11、BAV和升主動脈擴張,提示二者具有共同的發(fā)生機制。
　　 結(jié)論：和研究意義通過分析192例先天性LVOTO病理形態(tài)及VEGFA基因測序結(jié)果,我們得出以下結(jié)論:(1)先天性LVOTO病變常常合并發(fā)生,支持它們具有共同的發(fā)生機制。(2)首次報道VEGFA基因c.454C>T、c.973C>T、c.998G>A.和c.19-22dupGACA突變與LVOTO發(fā)生有關(guān),為LVOTO可能是寡基因遺傳的假設(shè)提供了證據(jù)。(3)首次報道VEGF