電脈沖介導的基因治療影響兔髂骨貼附移植成骨的實驗研究.pdf

1、第一部分電脈沖介導的pIRES-hVEGF165-EGFP對兔髂骨貼附移植植骨過程中早期血管生成的影響
　　 目的:探討電脈沖介導的pIRES-hVEGF165-EGFP體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的可行性以及對兔下頜骨髂骨貼附移植植骨過程中早期血管生成的影響。
　　 方法:48只新西蘭大白兔隨機分為3組，A組:pIRES-hVEGF165-EGFP+電穿孔組，B組:pIRES-hVEGF165-EGFP注射組，C組:生理鹽水+電穿孔組

2、。取兔自體髂骨貼附移植于下頜骨后，按組別在移植骨周圍分別注射重組質(zhì)粒pIRES-hVEGF165-EGFP(A、B組)和生理鹽水（C組），A、C組術后即時施加電刺激，B組不施加電刺激。術后3、7、14、21d切取組織，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)，檢測外源基因的表達:取心、肝、腎組織學HE染色，取右心血檢測肝、腎功能(ALT、AST、BUN、Scr);免疫組化法檢測移植骨血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、CD34蛋白的表達，并對

3、CD34表達陽性血管進行微血管密度(MVD)計數(shù)，對VEGF蛋白表達和MVD計數(shù)進行相關性分析。
　　 結(jié)果:三組兔血清中的ALT、AST、BUN、Scr差異無統(tǒng)計學差異(P＞0.017)，A組心、肝、腎組織學染色顯示各器官組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞正常，無變性、壞死。熒光顯微鏡下觀測GFP示A組3d時可見明顯綠色熒光蛋白表達，7d達到高峰，14d表達漸弱于7d，21d明顯減弱，但仍可以觀察到熒光;各時間點GFP表達明顯強于B組，C組未

4、見GFP表達。免疫組化結(jié)果顯示各組VEGF陽性表達于新生小血管內(nèi)皮細胞、成骨細胞、軟骨細胞及間質(zhì)細胞中，VEGF蛋白分布范圍與染色強度以A組最明顯，各時間點VEGF灰度值A組與B、C組之間有顯著性差異(P＜0.017)，B組、C組之間無顯著性差異(P＞0.05)，A組各時間點VEGF蛋白含量明顯高于B、C組。按照CD34在血管內(nèi)皮細胞的表達計算微血管密度(MVD)顯示A組MVD明顯高于B、C組，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.017);B、C組

5、間無顯著統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。術后各時間點三組VEGF蛋白表達與MVD之間均成正相關(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:1.電脈沖介導的重組質(zhì)粒pIRES-hVEGF165-EGFP體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染安全可行。
　　 2.轉(zhuǎn)染VEGF可以促進兔下頜骨髂骨貼附移植早期再血管化。
　　 第二部分電脈沖介導的pIRES-hVEGF165-EGFP對兔髂骨貼附移植成骨作用的影響
　　 目的:探討電脈沖介導的pIRES

6、-hVEGF165-EGFP體內(nèi)基岡轉(zhuǎn)染對兔下頜骨髂骨貼附移植骨成骨能力的影響。
　　 方法:60只新西蘭大白兔，隨機分為3組，A組:pIRES-hVEGF165-EGFP+電穿孔組，B組:pIRES-hVEGF165-EGFP注射組，C組:生理鹽水+電穿孔組。取兔自體髂骨貼附移植于下頜骨后，按組別在移植骨周圍分別注射重組質(zhì)pIRES-hVEGF165-EGFP（A、B組）和生理鹽水（C組），A、C組術后即時施加電刺激，B組不施

7、加電刺激。于術后第3、7、14、21、70d將移植骨連同宿主骨一同切取，大體觀察移植骨成活情況，并通過HE染色和免疫組化檢測第3、7、14、21、70d的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、骨鈣素(OC)、骨橋蛋白(OPN)、Ⅰ型膠原(COL-Ⅰ)的表達，比較各組間的表達差異，檢查移植骨改建情況，同時用排水法測量移植骨術前和術后70d的體積，計算移植骨吸收率。
　　 結(jié)果:術后70d各組移植骨與宿主骨之間完全融合，移植骨在三維方向上均

8、有吸收，A組骨塊體積明顯大于B、C組;A、B、C三組移植骨的吸收率分別為55.25％、62.38％和64.25％。HE染色顯示術后70d各組移植骨完全成活，未見死骨及吸收后空泡，未見破骨細胞，A組移植骨與宿主骨交界面骨性連接較B、C組明顯，未見明顯纖維連接。各組VEGF、OC、OPN、COL-Ⅰ免疫組織化學結(jié)果進行灰度值檢測及分析顯示，7d、14d及21d時，A組VEGF蛋白表達與B、C組差異有統(tǒng)計學意義;21d時，A組OC蛋白表達與B