化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1及Smad3表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過無菌未滅活的豬血清腹腔注射的方法建立肝纖維化大鼠模型，觀察化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠血清中透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)水平和病理形態(tài)學(xué)的影響；化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-betal-1,TGF-βi)表達(dá)的影響；化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Smad3蛋白表達(dá)的影響；從而探討化濁解毒調(diào)肝法治療本病的作用機(jī)制，為該法的臨床應(yīng)用提

2、供理論依據(jù)。
　　 方法：清潔級(jí)Wistar大鼠50只，雄性，體重200～220g。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、秋水仙堿治療組（簡稱西藥治療組）、化濁解毒調(diào)肝方低劑量組(HZD)、化濁解毒調(diào)肝方高劑量組(HZG)，每組10只。各組均普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)于22±2℃，濕度70％±5％清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。除正常對(duì)照組外，其余40只均采用未滅活的豬血清腹腔注射，每次0.5ml/只，固定時(shí)間為周

3、一、周五上午9點(diǎn)，連續(xù)8周。造模成功后HZD組給予含1.5g/ml生藥水煎劑灌胃，HZG組給予含3.0g/ml生藥水煎劑灌胃；秋水仙堿組給予0.154g/kg·d灌胃，均至12周末。正常對(duì)照組與模型組給予0.9％生理鹽水(10ml/kg)，日1次灌胃。12周末采用腹主動(dòng)脈取血，分離血清，用放射免疫分析法測定各組大鼠干預(yù)后血清中HA、PCⅢ水平。取大鼠肝組織，采用蘇木精-伊紅染色觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)的變化。采用免疫組化檢測大鼠肝組織TGF

4、-β1蛋白的表達(dá)；采用免疫印跡(Western-immunoblotting)測定大鼠肝組織中Smad3蛋白的表達(dá)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(?)±s）表示，運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析。
　　 結(jié)果：
　　 1一般情況：造模組1只大鼠死亡。正常對(duì)照組大鼠食欲佳，被毛光滑，精神狀態(tài)好，活潑好動(dòng)，體重逐漸增加。模型對(duì)照組大鼠精神萎靡、皮毛雜亂，黯淡無

5、光澤、進(jìn)食較正常組少、尿黃，有的大鼠鼻有出血，體重較前有所增加，但不如正常組增加顯著。西藥及中藥治療各組大鼠進(jìn)食、營養(yǎng)、活動(dòng)等尚可，體重逐漸增加，與正常組差別不顯著。
　　 2化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響
　　 肉眼觀察，正常組大鼠肝臟質(zhì)軟，略呈深紅色，新鮮，表面光滑，無任何斑點(diǎn)，突起，邊緣銳圓。模型組大鼠肝臟腫大明顯，質(zhì)地硬，顏色暗紅，表而粗糙不平，有的可見顆粒樣凸起，邊緣鈍。西藥及中藥治療組大鼠肝

6、臟腫大不明顯，質(zhì)較脆，表面較光滑，顏色略為暗紅，表面偶有細(xì)沙粒狀增生。光鏡下，正常組肝小葉排列整齊，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無變性壞死，纖維組織只在中央靜脈周圍、匯管區(qū)周圍有少量表達(dá)，含量極少。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞變性、壞死伴中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，纖維組織大量增生，個(gè)別動(dòng)物可見假小葉形成。秋水仙堿組與中藥治療各組肝臟損傷程度均較模型組輕，但秋水仙堿組與中藥治療各組之間病理形態(tài)無明顯差別。
　　 3化濁解毒調(diào)肝

7、方對(duì)肝纖維化大鼠血清HA、PCⅢ水平的影響
　　 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清HA、PCⅢ水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型對(duì)照組相比，12周末，各藥物干預(yù)組大鼠血清HA、PCⅢ水平下降，有顯著差異(P＜0.01)，秋水仙堿組、HZD組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）：HZG組與秋水仙堿組比較HA、PCⅢ水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織

8、TGF-β1蛋白表達(dá)的影響
　　 正常組大鼠肝組織見少許TGF-β1陽性表達(dá)細(xì)胞，表現(xiàn)為不均勻的棕黃色顆粒狀物。模型組大鼠肝組織中表達(dá)的陽性細(xì)胞比例顯著高于正常組，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組相比，各藥物干預(yù)組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且秋水仙堿組、HZD組之間TGF-β1蛋白表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）

9、；HZG組與秋水仙堿組比較TGF-β1蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 5化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Smad3蛋白表達(dá)的影響
　　 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠肝組織Smad3蛋白的表達(dá)量明顯增強(qiáng)(P＜0.01)?；瘽峤舛菊{(diào)肝方各劑量組及秋水仙堿組與模型組相比Smad3蛋白的表達(dá)量均有下降，差異顯著(P＜0.01)，HZD組與秋水仙堿組Smad3蛋白的表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05）

10、，HZG與秋水仙堿組比較Smad3蛋白表達(dá)量降低，差異顯著(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1化濁解毒調(diào)肝方能夠改善肝纖維化大鼠的一般狀況，且能夠減輕肝細(xì)胞的損傷，減少膠原纖維的生成，從而改善肝組織病理。
　　 2化濁解毒調(diào)肝方能顯著降低大鼠血清HA、PCⅢ型膠原含量，減少細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的生成，進(jìn)一步抑制肝纖維化的形成。
　　 3化濁解毒調(diào)肝方能顯著抑