海島棉GbRvd基因抗黃萎病機制研究.pdf

1、棉花是重要的纖維作物和經(jīng)濟作物，其生產(chǎn)對全球經(jīng)濟有著巨大的影響。棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌引起的維管束病害，嚴重影響棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，是棉花生產(chǎn)上的主要病害之一。長期生產(chǎn)實踐證明，防治棉花黃萎病的經(jīng)濟高效措施是選育和種植抗病品種。目前，傳統(tǒng)育種已無法滿足抗黃萎病品種的生產(chǎn)需求。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，為培育和改良黃萎病抗性新品種提供了一條新的途徑。利用基因工程進行棉花抗病育種的前提條件是挖掘抗病基因并解析其抗性機制。實踐表明，陸

2、地棉中缺少抗黃萎病資源，而海島棉對黃萎病表現(xiàn)高抗甚至免疫。因此，本研究以課題組前期構(gòu)建的黃萎病誘導(dǎo)下的海島棉（Gossypium barbadense）Pima90-53全長cDNA文庫為基礎(chǔ)，進行了抗黃萎病基因的挖掘，篩選并克隆了一個編碼CC-NBS-LRR(coiled-coil nucleotide-binding-site leucine-rich-repeat)類型的基因，并初步分析表明該基因與棉花抗黃萎病相關(guān)，命名為GbRv

3、d（RVd=Resistance to Verticillium dahliae）。
　　為進一步研究GbRvd抗病功能與機制，本研究對GbRvd進行了生物信息學分析，亞細胞定位，利用轉(zhuǎn)基因和組培技術(shù)將該基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥和煙草進行超表達，同時利用VIGS技術(shù)對GbRvd進行了沉默，分析基因超表達和沉默后對黃萎病的抗性變化，從組織結(jié)構(gòu)、生理生化等方面對該基因的抗病機制進行了初步探索，獲得的主要研究結(jié)果包括:
　　1.利用生物

4、信息學和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達技術(shù)對GbRvd進行了亞細胞定位預(yù)測與觀察。ProtComp軟件預(yù)測GbRvd為胞外（分泌）蛋白;GbRvd的跨膜預(yù)測結(jié)果顯示其包含3個跨膜域。GbRvd與GFP融合表達結(jié)果顯示的熒光信號主要分布于煙草表皮細胞質(zhì)和細胞膜。這些結(jié)果表明細胞膜和細胞質(zhì)是GbRvd分布的主要位置。
　　2.將GbRvd基因構(gòu)建真核超表達載體并分別轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因擬南芥的純合株系。通過對轉(zhuǎn)基因煙草

5、和擬南芥株系進行抗病性鑒定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株對黃萎病的抗性顯著提高。
　　3.利用VIGS技術(shù)沉默海島棉Pima90-53 GbRvd基因，沉默后的植株對黃萎病抗性顯著降低。黃萎病菌莖稈分離培養(yǎng)結(jié)果表明，GbRvd的沉默使黃萎病菌在植株莖稈中的擴展速度加快;PCR檢測結(jié)果顯示，GbRvd沉默后植株莖稈中黃萎病菌菌量明顯增加。
　　4.沉默GbRvd能夠?qū)е轮仓昴举|(zhì)素、酚類等次生代謝產(chǎn)物含量顯著降低;SA、NO和H2O2的含