黃萎病菌誘導(dǎo)下海島棉全長cDNA文庫分析及功能基因克隆.pdf

1、本研究以課題組前期創(chuàng)建的黃萎病菌誘導(dǎo)下海島棉全長cDNA文庫為基礎(chǔ)，對得到的EST序列，利用COG、KOG、KEGG和GO進(jìn)行功能注釋和代謝途徑聚類分析，對本文庫進(jìn)行篩選分析，篩選抗黃萎病相關(guān)基因，為棉花抗黃萎病研究增加新的基因資源，為棉花抗黃萎病育種奠定基礎(chǔ)。
　　經(jīng)過生物信息學(xué)、時(shí)空特異性表達(dá)分析，篩選出與抗黃萎病相關(guān)的基因GbCRK、GbVPE，并克隆基因的開放閱讀框序列;構(gòu)建GbCRK、GbVPE真核過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥

2、;構(gòu)建病毒介導(dǎo)的基因沉默載體轉(zhuǎn)化棉花，研究基因抗黃萎病作用。獲得主要結(jié)果如下:
　　1.對本文庫進(jìn)行的分析結(jié)果顯示，得到高質(zhì)量EST序列46192條，經(jīng)拼接得到23126個(gè)unigene，平均長度為818bp。能與NR、SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM數(shù)據(jù)庫有最佳匹配的基因分別占到總EST序列的78.07％、59.71％、78.43％、57.88％、80.24％。并且發(fā)現(xiàn)3027個(gè)其它作物已知抗病基因，4936

3、個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，680個(gè)海島棉特有的新基因。通過功能注釋發(fā)現(xiàn)，共有12248個(gè)基因注釋到COG中，發(fā)現(xiàn)了289個(gè)與抗黃萎病相關(guān)的途徑，還發(fā)現(xiàn)至少有一個(gè)GO注釋的達(dá)到20397個(gè)，其中注釋為生物過程（Biological Process）的有6893個(gè);注釋為細(xì)胞組分(Cellular Component)的有11305個(gè);注釋為分子功能(Molecular Function)的有8383個(gè);全部含有這三個(gè)功能注釋的有6184個(gè)基因。

4、　　2.GbCRK的ORF大小為1944 bp，編碼647個(gè)氨基酸組成的多肽，具有S-TK保守序列。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在三個(gè)不同抗、感品種中，GbCRK在感病品種“邯208”中表達(dá)水平最高，耐病品種“農(nóng)大棉8號(hào)”次之，抗病品種“Pima90-53”表達(dá)水平最低。三個(gè)品種在被黃萎病菌侵染后，GbCRK均短暫快速上升，接著短時(shí)間內(nèi)有所下降，最后保持在較高水平的表達(dá)，據(jù)此推測GbCRK在黃萎病菌侵染植株的應(yīng)答反應(yīng)中具有一定作用。

5、　　3.GbVPE的ORF大小為1467bp，編碼488個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，具有C13保守序列，屬于C13家族。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在感病品種“邯208”中表達(dá)水平最高。黃萎病菌侵染后，Gb VPE在三個(gè)品種中表達(dá)均呈先下降后上升最后穩(wěn)定保持在較高的表達(dá)水平上，彼此間只是到達(dá)的時(shí)間及峰值不同。推測Gb VPE與抗黃萎病互作的進(jìn)程相關(guān)。
　　4.分別構(gòu)建了植物真核過表達(dá)載體pCAM-GbCRK、pCAM-GbVPE，并轉(zhuǎn)化擬南芥