海島棉水楊酸途徑基因GbNDR1的克隆及抗黃萎病功能研究.pdf

1、黃萎病嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，種植抗病品種是最為經(jīng)濟(jì)有效的防治途徑。栽培陸地棉和海島棉具有不同的優(yōu)良特性，陸地棉產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)但缺乏免疫或高抗黃萎病材料;海島棉對(duì)黃萎病高抗且纖維品質(zhì)優(yōu)良。將海島棉黃萎病抗性轉(zhuǎn)育到陸地棉是現(xiàn)代棉花抗病育種的重要策略之一，抗黃萎病功能基因的挖掘及抗病分子機(jī)制研究對(duì)于棉花育種改良具有重要意義。
　　本研究以課題組前期構(gòu)建的黃萎病菌誘導(dǎo)下的海島棉cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)，篩選并克隆GbNDR1，研究黃萎病菌

2、及水楊酸誘導(dǎo)條件下基因的表達(dá)規(guī)律，明確NDR1基因功能，并探索基因抗病作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.克隆獲得海島棉GbNDR1基因。該基因序列全長(zhǎng)為756bp，其中包含627bp開(kāi)放閱讀框，無(wú)內(nèi)含子，GbNDR1編碼208個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為22.6kD;NDR1蛋白包含一個(gè)跨膜域，屬于脂溶性蛋白，且有一個(gè)信號(hào)肽;與哺乳動(dòng)物的LEA14蛋白具有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。棉花NDR1基因高度保守，陸地棉中含有GbNDR1的兩個(gè)同源

3、基因Gh_D13G1490和Gh_A13G1195，經(jīng)序列比對(duì)，與GbNDR1的序列相似度分別為99.68％和98.41％。GbNDR1基因與毛白楊NDR1基因具有較高的同源性(55.5％)。
　　2.黃萎病菌誘導(dǎo)下，Pima90-53根部組織中GbNDR1的表達(dá)量會(huì)顯著升高。這表明GbNDR1可受黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)，參與棉花的抗黃萎病反應(yīng)。棉花葉片外源噴施水楊酸后，GbNDR1基因的表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明水楊酸也可以誘導(dǎo)GbNDR1

4、基因的表達(dá)。
　　3.利用VIGS技術(shù)有效沉默棉花內(nèi)源NDR1基因的表達(dá)。沉默植株(TRV∷NDR1)和對(duì)照植株(TRV∷00)黃萎病抗性鑒定顯示，TRV∷NDR1植株開(kāi)始發(fā)病時(shí)間較對(duì)照植株提前，TRV∷NDR1植株病情指數(shù)(56.9)顯著高于對(duì)照植株(32.2)，表明抑制NDR1基因表達(dá)會(huì)降低棉花的抗病性。生化物質(zhì)測(cè)定表明，抑制NDR1基因表達(dá)，植株根部和葉片中水楊酸含量均會(huì)顯著降低且根部較葉片SA含量變化較早;植株H2O2含量

5、升高，TRV∷NDR1葉片溶液的電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照植株。
　　4.構(gòu)建了亞細(xì)胞定位載體pCamE-GbNDR1，利用農(nóng)桿菌侵染瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片。結(jié)果表明，在細(xì)胞質(zhì)膜有明顯的綠色熒光信號(hào)，說(shuō)明GbNDR1在細(xì)胞質(zhì)膜表達(dá)。
　　5.構(gòu)建了真核表達(dá)載體PBI121-GbNDR1，轉(zhuǎn)化擬南芥;并基于卡那霉素篩選和PCR檢測(cè)獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。
　　綜上，克隆獲得GbNDR1基因，其可受黃萎病菌和水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)。該基因通過(guò)