海島棉抗黃萎病基因GbVe抗病機制研究.pdf

1、我國棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌引起的土傳維管束病害，嚴(yán)重影響著棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。課題組前期克隆了海島棉GbVe并初步證明該基因在擬南芥中具有抗黃萎病功能，本研究將以前期獲得的轉(zhuǎn)GbVe擬南芥為材料，探索GbVe基因在抵抗黃萎病菌過程中對擬南芥根系、木質(zhì)素、H2O2、 POD及可能參與GbVe基因抗病反應(yīng)的基因EDS1、NDR1、BAK1、PR4、PR5的影響，揭示其抗病機制;同時，從不同抗感棉花品種中克隆Ve基因及其啟動子，比較其差異

2、。采用花粉管通道法將GbVe轉(zhuǎn)化棉花，獲得轉(zhuǎn)基因植株。研究結(jié)果將為深入揭示Ve基因抗病機制提供重要的理論依據(jù)。研究結(jié)果如下:
　　 1.接菌21 d時轉(zhuǎn)基因擬南芥莖中菌絲量明顯少于野生型，表明轉(zhuǎn)基因擬南芥中抑制了黃萎病菌在植株體內(nèi)的增殖;轉(zhuǎn)基因擬南芥的黃萎病抗性明顯比野生型擬南芥增強;且轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥根系發(fā)達(dá)。
　　 2.接種黃萎病菌后17d，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型的木質(zhì)素含量均比接菌前提高，但轉(zhuǎn)基因擬南芥的木

3、質(zhì)素含量在接菌前/后均明顯高于野生型。野生型在接種后30 hH2O2含量達(dá)到高峰，之后開始下降但仍高于接種前;而轉(zhuǎn)基因擬南芥在接種后12hH2O2達(dá)到高峰，之后明顯下降且低于接種前水平;到30h之后野生型H2O2含量約是轉(zhuǎn)基因擬南芥中的2倍。接種后轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片POD活性比野生型增加幅度大，野生型POD活性在18h到達(dá)頂峰，之后迅速下降，;而轉(zhuǎn)基因擬南芥在12h到達(dá)頂峰，之后基本穩(wěn)定，42 h后有所下降。
　　 3.接種后，轉(zhuǎn)

4、基因擬南芥中Gb Ve的表達(dá)量升高;EDS1表達(dá)量明顯升高且遠(yuǎn)大于野生型中的表達(dá)量;NDR1的表達(dá)量低于野生型中但后期增加;說明擬南芥中Gb Ve介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)依賴于EDS1、NDR1。接種后，擬南芥中PR4和PR5在轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥中表達(dá)量都升高，說明PR4、PR5參與GbVe介導(dǎo)的抗黃萎病反應(yīng)。GbVe介導(dǎo)的抗病反應(yīng)既依賴于SA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，又依賴于JA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)到途徑。然而BAK1表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中無明顯變化，但在

5、野生型中大量表達(dá)，說明擬南芥中Gb Ve介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)不依賴BAK1。
　　 4.不同抗感棉花品種冀棉11、冀棉20、中棉所8號、農(nóng)大棉8號、邯208、海7124、Pima90-53中克隆得到的Ve基因ORF全長都為3387 bp。不同陸地棉品種Ve的ORF序列完全一致;海島棉海7124與Pima90-53的Ve的ORF只有一個位點不同，而且并不影響它們所編碼的氨基酸序列;GhVe與GbVe有四個位點不同，但它們編碼的氨基酸

6、僅有一個位點不同，且此位點不在保守域中。
　　 5.克隆得到感病陸地棉冀11、中棉所8號的Ve基因的啟動子序列GhP大小為2067 bp，序列完全一致;抗病海島棉Pima90-53中克隆的Gb Ve的啟動子序列GbP大小為2083 bp; GhP與GbP相比有一段長16 bp的缺失，且有4個位點發(fā)生突變。生物信息學(xué)分析表明，GbP和GhP都含有與抗病、脅迫相關(guān)的調(diào)控元件GT1 CONSENSUS、GT1 GMSCAM4、WRKY

7、71OS等。GbP在134 bp處比GhP多1個與細(xì)胞分裂素調(diào)控有關(guān)的ARR1 AT元件，在138 bp處多1個與保衛(wèi)細(xì)胞特異基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)的TAAAGSTKST1元件;GbP和GhP中與脅迫響應(yīng)相關(guān)的 DOFCOREZM元件有一個位置不同;GbP在1552 bp處有1個S1FBOXSORPS1 L21和1個S1FSORPL21元件，這兩個元件與質(zhì)體核糖體蛋白S1、L21的調(diào)控相關(guān)，而GhP中無此類調(diào)控元件。啟動子序列的差異可能是影