海島棉GbNPR1基因的表達(dá)特性及功能分析.pdf

1、目的:
　　海島棉是我國(guó)重要的栽培棉種之一,新疆作為我國(guó)唯一的海島棉產(chǎn)區(qū),優(yōu)越的自然生態(tài)條件為新疆海島棉的發(fā)展提供了得天獨(dú)厚的發(fā)展優(yōu)勢(shì)。然而,近年來(lái)海島棉枯萎病的日益加劇已嚴(yán)重影響了海島棉的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此,利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)挖掘抗病基因資源,并研究其在海島棉抗病中的功能,將為培育海島棉抗枯萎病品種奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　本研究以新疆海島棉為材料,采用RT-PCR技術(shù)克隆與棉花抗枯萎病相關(guān)的GbNPR1基因,并對(duì)

2、該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)分析該基因在枯萎病菌、水楊酸和乙烯誘導(dǎo)下的表達(dá)特性;構(gòu)建植物的過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖轉(zhuǎn)化將該基因?qū)牒u棉,初步研究其功能;探索在田間利用農(nóng)桿菌侵染花柱頭法和農(nóng)桿菌注射花苞法轉(zhuǎn)化外源基因的有效途徑。
　　結(jié)果:
　　1、從海島棉中克隆了GbNPR1基因,該基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1764bp,編碼587個(gè)氨基酸,編碼蛋白為一親水蛋白;含有一

3、個(gè)BTB/POZ結(jié)構(gòu)域、三個(gè)錨蛋重復(fù)序列(ANK)和NPR1蛋白家族代表性的NPR1_like_C結(jié)構(gòu)域。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲與α螺旋所占的比例分別為49.40％和42.42%。
　　2、qPCR分析結(jié)果表明,枯萎病菌誘導(dǎo)后,GbNPR1基因在抗病和感病品種中表達(dá)量均明顯增加,最高值分別是誘導(dǎo)前的7.2倍和5.4倍,但在抗病材料H116H-1中的表達(dá)量普遍高于感病品種;抗病品種中GbNPR1基因?qū)λ畻钏岷鸵蚁┚忻黠@響應(yīng),而在

4、感病材料中該基因?qū)σ蚁┱T導(dǎo)變化不明顯。
　　3、通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的海島棉莖尖遺傳轉(zhuǎn)化,共獲得35株轉(zhuǎn)基因棉花,經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè),21株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(其中新海14號(hào)16株,新海21號(hào)5株)。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),經(jīng)枯萎病菌處理后,GbNPR1基因在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性棉花中表達(dá)量明顯高于非轉(zhuǎn)基因棉花。
　　4、通過(guò)卡那霉素篩選和PCR檢測(cè),結(jié)果表明,農(nóng)桿菌侵染花柱頭法和農(nóng)桿菌注射花苞法均能獲得陽(yáng)性植株,陽(yáng)性植株分別是12株和8株,兩種方法P