外加低壓穩(wěn)恒直流電場對兔急性心肌梗死后血管生成的作用及機制研究.pdf

1、一、背景與目的：
　　 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是當今人類健康的“頭號敵人”，冠心病治療費用也位列許多國家政府衛(wèi)生保健支出之首。如何有效地防治冠心病成為臨床心血管病學的重要課題。雖然經皮冠狀動脈介入(PCI)治療或/和冠狀動脈旁路移植術(CABG)并聯(lián)合強化的藥物治療獲得重要突破和進展，但仍有部分冠心病患者不能有效恢復完全的心肌血流灌注，還有20％～70％的冠心病患者不能施行PCI或CABG，或者接受了不完全的血運重建

2、，使患者死亡率增高，臨床預后險惡。治療性血管生成通常利用外源性重組基因治療以促進缺血心肌的側支循環(huán)形成，使冠脈灌注得以恢復，從而改善心臟功能和臨床預后，是嚴重缺血性心臟病患者傳統(tǒng)治療措施的補充或替代方法。
　　 組織損傷后產生內源性電場，這是種穩(wěn)恒直流電場，具有促進損傷愈合等生物學效應。損傷和缺血組織中存在電勢差，當這個直流電場達到150～400mv/mm時，能促使包括平滑肌細胞和內皮細胞在內的所有的血管壁細胞明顯地延長、垂直取

3、向和定向遷移，從而觸發(fā)血管新生、并進一步發(fā)展成熟為具有功能作用的側支循環(huán)。因而，穩(wěn)恒直流電場刺激可望成為治療性血管生成的新希望。組織缺血缺氧是血管生成的原始刺激因素，血管內皮生長因子(VEGF)是血管形成的特異性和關鍵性生長因子。缺血導致心肌細胞中缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的激活，進一步刺激VEGF等生長因子的表達，而磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)通路在通過HIF-1α調節(jié)的VEGF的表達中起重要作用。第10號

4、染色體丟失的張力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)，對P I3K/Akt信號通路起負調節(jié)作用。最近的研究證實外加電場對細胞的生物學效應是通過PTEN/PI3K信號途徑來發(fā)揮作用的。
　　 本課題在以往研究的基礎上以兔心臟為研究的基本模型，對外加低壓穩(wěn)恒直流電刺激直接作用于心臟的安全性、血管生成的有效性、血管生成后對兔心功能的影響進行全面的分析，并進一步探討外加低壓穩(wěn)恒直流電影響急性心肌梗死(AMI)后梗死邊緣區(qū)血管生成的可能機制。

5、
　　 二、方法：
　　 第一部分外加低壓穩(wěn)恒直流電場對AMI兔的安全性評估。
　　 日本大耳兔30只，隨機分為治療組和對照組。家兔開胸后直接在心外膜上，在結扎的冠狀動脈左回旋支的兩側平行安放一對刺激電極。電極為含量99％鉑(Pt)條改制的長10.0mm、寬1.0mm、厚0.5mm片狀鉑金電極頭。術后立即給予電場強度4.0V/cm、30min/d直流電治療，直至術后4周。觀察低壓穩(wěn)恒直流電場對家兔呼吸、循環(huán)、心電

6、生理、血液、血生化以及病理組織學的影響。
　　 第二部分外加低壓穩(wěn)恒直流電場對兔AMI后血管生成的影響及其效應
　　 日本大耳兔95只，隨機分為假手術組(SH組)、心肌梗死組(MI組)、電治療組(EFs組)[包括2.0V/cm電治療組(2EFs組)和4.0V/cm電治療組(4EFs組)]，除SH組以外，其余三組分別觀察術后1天、3天、5天、7天、2周和4周6個時相點，每組5只兔。在相應的模型建立后第二天開始，給予兔體外施

7、加低壓穩(wěn)恒直流電刺激(電場強度2.0V/cm或4.0V/cm)，持續(xù)30min/d，直到術后各組觀察終點。多導生理儀有創(chuàng)監(jiān)測左室血流動力學參數(shù)和股動脈壓；處死動物后，測量左、右心室的重量；通過Masson染色判斷梗死面積；VⅢ因子免疫組化染色觀察毛細血管密度；RT-PCR檢測單核細胞趨化蛋白-1的表達以判斷炎癥反應強度；RT-PCR及Western-blot檢測基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達。
　　 第三部分外加低壓穩(wěn)恒

8、直流電場促進兔AMI后血管生成的機制
　　 在第二部分研究基礎上，增加以羅格列酮干預的18只兔。以免疫組化方法、RT-PCR及Western-bolt觀察上述各組缺血心肌組織VEGF的表達；免疫組化方法及RT-PCR檢測HIF-1α的表達；RT-PCR及Western-bolt觀察羅格列酮干預前后PTEN的表達；VⅢ因子免疫組化染色觀察羅格列酮干預前后心肌毛細血管密度。
　　 三、結果：
　　 (1)通過胸骨正中

9、切口開胸、結扎左冠狀動脈回旋支(LCX)建立AMI的方法，不用氣管插管或氣管切開建立人工輔助呼吸，簡化了手術操作、保持胸膜的完整、避免胸腔大血管的損傷，減少了感染和出血等并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 (2)經過改良后的鉑電極，電極頭面積較早期實驗所設計的增加近2/3并鑿刻小槽，有利于電極固定在心外膜上。電極柔韌性增加，通過延長的皮下隧道固定于兔的頸背部的方法便于手術操作、安全、可靠，有效地降低了電極脫落的機率。
　　 (3)4.

10、0V/cm、30min/d的低壓穩(wěn)恒直流電場對AMI兔在手術后4周之內，無論是呼吸、循環(huán)、血液、生化、心肌病理組織學改變還是一般情況等，與對照組比較無顯著差異，提示都是安全的。
　　 (4)低壓穩(wěn)恒直流電場治療后，兔MI邊緣區(qū)心肌組織中毛細血管的密度比MI對照組顯著增多，尤其在4.0V/cm場強的電治療組。毛細血管的密度在術后第5天達到高峰，此后稍有減少并穩(wěn)定至術后4周。同時EFs組在術后4周MI面積較MI組縮小，左心室功能顯著

11、改善。
　　 (5)AMI后心肌組織中MCP-1表達較SH組顯著增加，但EFs組和MI組無統(tǒng)計學差異；術后4周，EFs組MMP-2表達較MI組顯著降低。
　　 (6)MI缺血心肌組織中HIF-1α以及VEGF表達較正常心肌組織增加，給予外加低壓穩(wěn)恒直流電刺激后在一定時間窗內可顯著促進梗死邊緣區(qū)心肌組織中HIF-1α以及VEGF的表達；
　　 (7)正常心肌組織中PTEN高表達，心肌梗死后PTEN表達下調。外加低壓

12、穩(wěn)恒直流電刺激后3天內使梗死邊緣區(qū)心肌組織中PTEN表達較對照組降低，隨后PTEN表達在電場干預下迅速增加，并在術后4周達到較高的水平；
　　 (8)羅格列酮可使缺血心肌組織中PTEN表達顯著增加并伴隨著VEGF表達和毛細血管密度的降低，提示低壓穩(wěn)恒直流電刺激可能通過PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF通路促進MI后梗死邊緣區(qū)心肌組織血管生成的增加。
　　 四、結論：
　　 (1)4.0V/cm、3

13、0min/d的外加低壓穩(wěn)恒直流電場對兔AMI后4周之內，無論是對呼吸、循環(huán)、血液、生化、心肌病理組織學改變的影響還是一般情況等，與對照組比均無顯著差異，提示是安全的。
　　 (2)外加低壓穩(wěn)恒直流電治療4周后，MMP-2表達較MI組顯著降低，MI面積縮小，同時左心室心肌肥厚指數(shù)下降，左室收縮功能明顯改善，尤其在4.0V/cm場強的電治療組。
　　 (3)外加低壓穩(wěn)恒直流電場治療后，梗死邊緣區(qū)心肌組織中毛細血管的密度比MI

14、對照組顯著增加，尤其在4.0V/cm場強的電治療組。延長電刺激的時間，毛細血管密度并沒有繼續(xù)進一步增加。
　　 (4)外加低壓穩(wěn)恒直流電刺激后早期，缺血心肌組織中PTEN表達較MI對照組降低，同時VEGF及HIF-1α表達升高；羅格列酮藥物干預后PTEN表達增加并伴隨著VEGF表達和毛細血管密度顯著降低，提示外加低壓穩(wěn)恒直流電刺激可能通過PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF通路，促進MI后梗死邊緣區(qū)心肌組織血管生成