外加低壓穩(wěn)恒直流電場對兔腹主動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)皮修復(fù)及內(nèi)膜增生影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1.背景與目的： 迄今靶病變血管再狹窄(RS)仍然是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)術(shù)后最主要的問題之一。Forrester等提出，支架內(nèi)RS的主要原因是血管內(nèi)膜損傷后，自身愈合過程導(dǎo)致的新生內(nèi)膜增生，是血管內(nèi)皮修復(fù)和內(nèi)膜增殖的對立平衡失調(diào)的結(jié)果。當(dāng)前對于RS的防治主要集中在藥物、基因治療、介入治療以及外科手術(shù)等方面，雖然這些治療手段從一定程度上減輕了RS所造成的危害，但對于血管損傷處的內(nèi)皮修復(fù)和抑制內(nèi)膜增生的作用仍難以令人滿意。如何

2、尋找一種更佳的方法促進(jìn)血管損傷后再內(nèi)皮化和抑制過度的新生內(nèi)膜增殖，從而達(dá)到預(yù)防和治療RS的目的是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。 眾多的研究相繼證實(shí)內(nèi)源性電場廣泛存在于損傷愈合、組織再生、胚胎發(fā)育以及腫瘤的形成等生理或病理生理過程。在機(jī)體自身產(chǎn)生的生物電場不足以促進(jìn)損傷愈合的過程時(shí)，在損傷區(qū)與非損傷區(qū)之間施加直流電場可以增強(qiáng)損傷愈合速率。內(nèi)皮損傷在增殖性血管疾病發(fā)病中起始動(dòng)和促進(jìn)作用，平滑肌細(xì)胞( VSMCs)的增殖和遷移是構(gòu)成血管新生內(nèi)膜增生

3、的直接原因。有研究發(fā)現(xiàn)，生理強(qiáng)度直流電場對血管內(nèi)皮細(xì)胞的多種生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。外加電場還可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架F-actin合成和裝配，進(jìn)而影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)行為。研究表明外加電場可以影響VSMCs的定向遷移，這種作用是與細(xì)胞生長相關(guān)的一種主動(dòng)行為，而不是在電場作用下的一種被動(dòng)的泳動(dòng)。離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外加電場也可以影響VSMCs的增殖。內(nèi)源性電場也存在于血管周圍，在體情況下，適宜的外加電場可以改善電場作用局部的動(dòng)脈粥樣硬化程度。因

4、此，在體情況下外加低壓穩(wěn)恒直流電場是否會影響血管周圍的內(nèi)源性電場，是否會影響血管損傷后的修復(fù)過程值得探討。 本課題小組已在前期研究中初步探討了穩(wěn)恒直流電場對培養(yǎng)VSMCs的作用及機(jī)制，并設(shè)計(jì)了電場作用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的電源裝置。在此基礎(chǔ)上，本課題進(jìn)一步將穩(wěn)恒直流電場作用于血管損傷動(dòng)物模型，研究其對血管損傷后新生內(nèi)膜增生以及血管再內(nèi)皮化的影響及其機(jī)制。 2.方法： 第一部分初步探討外加低壓穩(wěn)恒直流電場作用于血管時(shí)的可行性

5、及安全有效的方式。 (1)將自制的鉑電極置于家兔腹主動(dòng)脈兩側(cè)腰大肌內(nèi)，或?qū)K電極分別置于腹主動(dòng)脈血管內(nèi)和家兔頸背部，觀察不同電場作用方式、不同電場強(qiáng)度下血管局部損傷情況的變化。 (2)將兩自制鉑電極置于家兔腹主動(dòng)脈兩側(cè)腰大肌內(nèi)作為刺激電極，通過多對測量電極觀察不同電壓強(qiáng)度下兔腹主動(dòng)脈周圍電勢差的變化情況。 第二部分將健康日本大耳白兔65只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組、實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組分為3.0V、4.0V兩個(gè)亞組

6、。建立兔腹主動(dòng)脈球囊損傷模型，將自制的鉑電極置于家兔腹主動(dòng)脈兩側(cè)腰大肌內(nèi)，根據(jù)分組情況給與實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)的穩(wěn)恒直流電場刺激，于術(shù)后1周，術(shù)后2周，術(shù)后4周處死動(dòng)物。通過伊文氏藍(lán)染色、CD31免疫組化、掃描電鏡來觀察血管再內(nèi)皮化情況；觀察各組離體血管環(huán)對不同濃度乙酰膽堿的最大舒張反應(yīng)，判斷血管內(nèi)皮依賴性舒張功能；通過HE染色，天狼猩紅染色以及Westem-blot來觀察血管新生內(nèi)膜增生情況和I型、III型膠原蛋白的表達(dá)。 第三部分通過

7、PCNA免疫組化和TUNEL法觀察外加穩(wěn)恒直流電場刺激后血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡情況變化，通過免疫組化、Western-blot和實(shí)時(shí)定量PCR來觀察電場刺激后P27和PTEN的表達(dá)變化。 3.結(jié)果 (1)將鉑絲電極置入血管內(nèi)，連接血管外電極和電源可構(gòu)成透壁電場。此干預(yù)方式使用1.OV電壓刺激即可灼傷血管內(nèi)膜。由于電極置入血管內(nèi)，極易引起血栓的形成。 (2)將鉑電極置入兔腹主動(dòng)脈兩側(cè)腰大肌，連接電源后構(gòu)成平面電場

8、，此干預(yù)方式比較安全。通電后即刻血管外膜間和血管內(nèi)外膜問的電勢差不會馬上發(fā)生改變；通電后30分鐘，3.0V和4.0V組血管外膜間和血管內(nèi)外膜間的電勢差與通電前相比均顯著升高(P<0.01)；斷開電源30分鐘后，3.OV和4.OV組血管內(nèi)外膜間的電勢差仍高于通電前(P<0.01)，兩刺激電極間仍能保持較高的電勢差。 (3)伊文氏藍(lán)染色結(jié)果顯示3.0V組和4.0V組各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮再生面積/損傷總面積比值與對照組相比均無顯著差異(P>0

9、.05)。4.OV電場干預(yù)4周后血管環(huán)對Ach的最大舒張反應(yīng)高于對照組和3.0V組(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)血管環(huán)對Ach的最大舒張反應(yīng)與對照組和3.0V組比較均無顯著差異。 (4)在球囊損傷后2周和4周，3.0V組和4.0V組內(nèi)/中膜面積比值均顯著小于對照組，3.0V組和4.0V組之間比較無顯著差異(P>0.05)。天狼猩紅染色顯示3.0V組和4.0V組血管新生內(nèi)膜中I型、III型膠原蛋白的表達(dá)低于對照組。 (5)在

10、兔腹主動(dòng)脈球囊損傷模型，血管內(nèi)膜損傷后血管壁的細(xì)胞凋亡水平較低，3.OV或4.OV外加穩(wěn)恒直流電場干預(yù)后細(xì)胞凋亡未見增加； (6)在球囊損傷后2周，3.0V組和4.0V組PCNA陽性增殖細(xì)胞指數(shù)均顯著小于對照組(P<0.01)，球囊損傷后4周電場干預(yù)組與對照組相比增殖細(xì)胞指數(shù)間均無顯著差異(P>0.05)； (7)3.0V和4.0V外加穩(wěn)恒直流電場均可以上調(diào)血管損傷后P27的表達(dá)； (9)血管球囊損傷后，PTEN

11、的表達(dá)下降，給予3.0V或4.0V外加穩(wěn)恒直流電場干預(yù)后，血管壁內(nèi)PTEN蛋白的表達(dá)上調(diào)。 4.結(jié)論 (1)外加穩(wěn)恒直流電場干預(yù)不會影響血管損傷后的再內(nèi)皮化速度，4.0V電場干預(yù)4周后血管內(nèi)皮依賴性舒張功能較對照組和3.OV組有改善，提示適宜的外加電場可能有利于內(nèi)皮功能的恢復(fù)。 (2)適宜的外加穩(wěn)恒直流電場可以抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的增生，同時(shí)也抑制了新生內(nèi)膜內(nèi)I型、III型膠原蛋白的表達(dá)。 (3)外加穩(wěn)