蘇云金芽胞桿菌基因工程菌G033A發(fā)酵代謝及增效物質(zhì)回收研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bt)在微生物防治害蟲(chóng)的實(shí)踐中占有極為重要的地位。隨著它在防治害蟲(chóng)中的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)蘇云金芽胞桿菌的研究也逐漸發(fā)展起來(lái)。但是傳統(tǒng)Bt菌株存在殺蟲(chóng)譜窄、毒力低、單一制劑大面積反復(fù)使用造成害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約Bt的發(fā)展與應(yīng)用。 通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)手段，分離克隆不同殺蟲(chóng)活性的殺蟲(chóng)晶體蛋白(ICPs)基因，并將不同殺蟲(chóng)活性的ICP基因進(jìn)行重組，獲得殺蟲(chóng)譜廣、持效期長(zhǎng)、或具有殺蟲(chóng)抗病等多種功能的多樣性Bt系列產(chǎn)品

2、。本論文圍繞兼治鱗翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)的Bt工程菌G033A進(jìn)行了培養(yǎng)基優(yōu)化，發(fā)酵代謝，增效物質(zhì)的回收等一系列研究，為加速Bt工程菌的產(chǎn)業(yè)化奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 主要內(nèi)容包括： 應(yīng)用響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化G033A發(fā)酵培養(yǎng)基，通過(guò)部分因子篩選設(shè)計(jì)、最陡坡試驗(yàn)、和中心組合設(shè)計(jì)，并采用多元一次和二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，得到一個(gè)最優(yōu)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基主要成份為：4％葡萄糖，4.388％花生粕；

3、0.391％酵母抽提物；0.315％玉米漿粉及微量元素。該培養(yǎng)基作為G033A的發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵水平對(duì)棉鈴蟲(chóng)的效價(jià)為5783IU/μl。RSM法采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用很少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量和時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面研究，可快速獲得明確，有目的的結(jié)論，為Bt培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化提供了一種新的方法。 利用30L全自動(dòng)不銹鋼發(fā)酵罐，進(jìn)行了G033A分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵代謝研究。對(duì)培養(yǎng)過(guò)程各參數(shù)的變化、影響發(fā)酵因素及外源基因表達(dá)需求進(jìn)行分析，根據(jù)G

4、033A不同時(shí)空表達(dá)啟動(dòng)子的特點(diǎn)，確定了補(bǔ)料濃度、補(bǔ)料時(shí)機(jī)。采用補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝，發(fā)酵過(guò)程控制pH6.8-7.2，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速使溶氧維持在G033A臨界氧之上，保持發(fā)酵液還原糖水平控制在0.5-1％，葡萄糖消耗總量為6.8％，補(bǔ)加水解植物復(fù)合氨基酸共1％，發(fā)酵液130kD/65kD晶體蛋白含量為0.58％/0.82％，增效倍數(shù)達(dá)5.5倍，發(fā)酵液菌數(shù)為62億/ml，發(fā)酵液對(duì)棉鈴蟲(chóng)效價(jià)為7012IU/μl，發(fā)酵水平較分批發(fā)酵顯著提高。研究表明，

5、對(duì)一個(gè)已經(jīng)組建完成的工程菌來(lái)說(shuō)，選擇最合適的培養(yǎng)條件是進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟。 溶氧已成為Bt高密度發(fā)酵的主要限制因素，本論文還就攪拌葉類型、溫度和罐壓對(duì)BtG033A發(fā)酵過(guò)程的溶氧影響進(jìn)行了研究，如下組攪拌葉用平葉，中組攪拌用箭葉和彎葉時(shí)，充分混合可有效改善供氧；在工程菌BtG033A發(fā)酵過(guò)程中，溫度每下降0.1℃，溶氧升高約1％；罐壓從0.05MPa提高到0.065MPa，溶氧濃度平均增加12％左右，發(fā)酵過(guò)程應(yīng)合理控制對(duì)數(shù)

6、期的溫度和罐壓來(lái)提高溶氧。這些研究工作對(duì)于指導(dǎo)G033A生時(shí)如何有效控制發(fā)酵過(guò)程溶氧高于臨界之上具有指導(dǎo)和實(shí)踐意義。 G033A高產(chǎn)ZwittermicinA，本課題建立了離子交換樹(shù)脂的方法回收G033A發(fā)酵上清液中ZwittermicinA的工藝，采用該工藝增效物質(zhì)回收率達(dá)93.1％，增效粉單位達(dá)463U/g。研究表明，離交工藝回收G033A發(fā)酵上清液中的增效物質(zhì)是一種可行的，具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的方式，能得高質(zhì)量的Zwitter