生長(zhǎng)素釋放肽對(duì)CLP小鼠介導(dǎo)ALI的保護(hù)作用與相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、研究目的：急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾病過(guò)程中，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。目前認(rèn)為其發(fā)生的機(jī)制為瀑布性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肺損傷，其中凝血和纖溶紊亂也參與急性肺損傷的病程，早期促凝機(jī)制增強(qiáng)，而纖溶過(guò)程受到抑制，引起廣泛血栓形成和纖維蛋白的大量沉積，在急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用[1]。ALI/

2、ARDS的治療是一個(gè)全身的綜合性的治療，盡管保護(hù)性通氣策略使其死亡率有所降低，但其發(fā)病率和死亡率仍然很高。 為尋求新的特異性的治療手段，目前許多研究者開(kāi)始把目光轉(zhuǎn)向在ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制中有重要意義的細(xì)胞因子、纖溶系統(tǒng)的異常。近期的研究對(duì)纖溶與炎癥之間潛在的相互作用得到了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，結(jié)構(gòu)和功能研究也越來(lái)越多地顯示纖溶系統(tǒng)和炎癥之間存在密切聯(lián)系，可能共同促進(jìn)了急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。有研究顯示核因子-κB（NF-κB）通路的激

3、活是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）分泌的重要通路之一。Takeshita等體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α通過(guò)NF-κB介導(dǎo)細(xì)胞PAI-1mRNA的表達(dá)，另有研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素釋放肽（Ghrelin）通過(guò)抑制NF-κB而抑制TNF-α誘導(dǎo)PAI-1mRNA的表達(dá)。應(yīng)用Ghrelin有可能降低ALI/ARDS中的炎癥反應(yīng)和改善纖溶狀態(tài)。 Ghrelin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)由28個(gè)氨基酸組成的腦腸多肽，主

4、要來(lái)源于胃，是生長(zhǎng)激素促泌素受體，研究證明Ghrelin及其受體存在于全身多處，決定其功能的多樣性，由于Ghrelin及其受體在肺組織的表達(dá)表明其可能具有治療肺部疾病的功能，研究者們對(duì)于Ghrelin功能進(jìn)行了廣泛的研究，用Ghrelin治療膿毒癥誘導(dǎo)ALI成為新的研究熱點(diǎn)。最近在國(guó)外將Ghrelin應(yīng)用于膿毒癥的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)。Ghrelin可能通過(guò)NF-κB途徑降膿毒癥誘導(dǎo)ALI/ARDS小鼠血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6等

5、促炎因子，增加肺血流量，改善肺組織，減輕肺水，提高生存率。但國(guó)內(nèi)仍沒(méi)有類(lèi)似的報(bào)道，而且對(duì)于Ghrelin在治療膿毒癥上沒(méi)有提供一個(gè)最佳治療劑量，而Ghrelin治療ALI的纖溶作用只限于體外實(shí)驗(yàn)。目前還沒(méi)有相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ghrelin是否通過(guò)減低NF-κB介導(dǎo)TNF-α表達(dá)PAI-1，它在治療ALI機(jī)制還要進(jìn)一步探討。因此，使用不同濃度Ghrelin對(duì)CLP介導(dǎo)肺損傷中細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)效應(yīng)，觀察其能否降低肺血管通透性，減輕肺損傷的嚴(yán)重

6、程度，尋找一個(gè)最佳治療組。同時(shí)，將觀察Ghrelin對(duì)NF-κB的表達(dá)和PAI-1、t-PA分泌是否有影響，探討其可能的作用機(jī)制。為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容與方法： 第一部分：生長(zhǎng)素釋放肽干預(yù)對(duì)CLP介導(dǎo)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用 1.隨機(jī)將昆明小鼠分為正常組（NS）、假手術(shù)組（Sham）、盲腸結(jié)扎穿孔組（CLP）和Ghrelin干預(yù)組（Ghrelin+CLP）；再將Ghrelin干預(yù)組分成5nmol

7、/kg、10nmol/kg、20nmol/kg、40nmol/kg、80nmol/kg五個(gè)劑量組，分別用A、B、C、D、E表示。而每個(gè)劑量組分別在CLP后5h、10h、15h時(shí)間段分次腹腔注射Ghrelin。 2.CLP組、Ghrelin干預(yù)組20h后處死小鼠、取樣，正常組、假手術(shù)組則給予腹腔注射生理鹽水（2.5 ml/kg）觀察20小時(shí)，處死小鼠，取樣，測(cè)定和比較各組的損傷指標(biāo)，，包括肺濕/干重比值、肺水含量、肺組織水通道蛋白

8、測(cè)定，血清炎癥介質(zhì)以及組織病理學(xué)評(píng)分，評(píng)估小鼠肺損傷，計(jì)算生存率。 第二部分：生長(zhǎng)素釋放肽干預(yù)對(duì)CLP的機(jī)制——NF-κB信號(hào)通路和纖溶系統(tǒng) 1.免疫組化測(cè)定肺組織NF-κB的表達(dá)。 2.ELISA測(cè)定血漿PAI-1和t-PA水平，計(jì)算t-PNPAI-1比值。 結(jié)果： 第一部分：生長(zhǎng)素釋放肽對(duì)CLP介導(dǎo)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用 1.Ghrelin干預(yù)對(duì)CLP誘導(dǎo)ALI/ARDS小鼠肺血管通

9、透性的影響 1.1.Ghrelin各干預(yù)組肺水含量顯著低于CLP組，Ghrelin干預(yù)C組肺水含量最少，但高于正常組和假手術(shù)組。Ghrelin干預(yù)C組肺濕/干重比值顯著低于CLP組，但較正常組和假手術(shù)組高。 1.2.Ghrelin干預(yù)C組水通道蛋白AQP1、AQP4的水平表達(dá)顯著高于CLP組，但低于正常組和假手術(shù)組。 1.3.CLP組肺組織學(xué)損傷評(píng)分明顯高于正常組和假手術(shù)組，達(dá)到ALI標(biāo)準(zhǔn)，Ghrelin干預(yù)C組

10、的肺組織病理顯示肺組織損傷較CLP減輕。 2.Ghrelin干預(yù)組對(duì)CLP誘導(dǎo)ALI小鼠血清炎癥介質(zhì)的影響： ELISA結(jié)果顯示：Ghrelin干預(yù)組血清TNF-α水平均顯著低于CLP組，B組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、C、D、E組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ghrelin-C組IL-6，IL-1β水平均顯著低于CLP組，但較正常組和假手術(shù)組高。 3.Ghrelin干預(yù)組對(duì)CLP誘導(dǎo)ALI小鼠生存率的影響： CLP組在手術(shù)后7天

11、內(nèi)全部死亡，與正常組、假手術(shù)組、Ghrelin-C組的平均生存時(shí)間明顯差別，Ghrelin-C組有3只小鼠存活生存時(shí)間超過(guò)10天，采用Kaplan-Meier Survival分析Ghrelin對(duì)CLP小鼠存活率的影響，與CLP組相比Ghrelin干預(yù)C組的存活時(shí)間則顯著延長(zhǎng)，存活率顯著提高20％，Ghrelin干預(yù)CLP小鼠后生存率得到改善。 第二部分：生長(zhǎng)素釋放肽干預(yù)對(duì)CLP的機(jī)制——NF-κB信號(hào)通路和纖溶系統(tǒng) 1

12、.免疫組化結(jié)果顯示：與正常組、假手術(shù)組相比，CLP組肺組織NF-κB表達(dá)顯著增強(qiáng)，Ghrelin干預(yù)C組的NF-κB表達(dá)強(qiáng)度比CLP組弱，與其減輕肺損傷相關(guān)。 2.ELISA結(jié)果顯示：與正常組、假手術(shù)組相比，CLP組t-PA水平輕度增高、PAI-1水平明顯增高，t-PA/PAI-1比值明顯下降，與ALI時(shí)纖溶抑制有關(guān)。與CLP組相比，Ghrelin-C組血漿t-PA水平輕度升高、PAI-1水平明顯下降、t-PA，PAI-1比值明