生長素釋放肽對CLP小鼠介導ALI的保護作用與相關信號轉導機制.pdf

1、研究目的：急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指在嚴重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾病過程中，肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。目前認為其發(fā)生的機制為瀑布性炎癥反應導致的肺損傷，其中凝血和纖溶紊亂也參與急性肺損傷的病程，早期促凝機制增強，而纖溶過程受到抑制，引起廣泛血栓形成和纖維蛋白的大量沉積，在急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用[1]。ALI/

2、ARDS的治療是一個全身的綜合性的治療，盡管保護性通氣策略使其死亡率有所降低，但其發(fā)病率和死亡率仍然很高。 為尋求新的特異性的治療手段，目前許多研究者開始把目光轉向在ALI/ARDS發(fā)病機制中有重要意義的細胞因子、纖溶系統(tǒng)的異常。近期的研究對纖溶與炎癥之間潛在的相互作用得到了進一步的認識，結構和功能研究也越來越多地顯示纖溶系統(tǒng)和炎癥之間存在密切聯(lián)系，可能共同促進了急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。有研究顯示核因子-κB（NF-κB）通路的激

3、活是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）分泌的重要通路之一。Takeshita等體外實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α通過NF-κB介導細胞PAI-1mRNA的表達，另有研究發(fā)現(xiàn)生長素釋放肽（Ghrelin）通過抑制NF-κB而抑制TNF-α誘導PAI-1mRNA的表達。應用Ghrelin有可能降低ALI/ARDS中的炎癥反應和改善纖溶狀態(tài)。 Ghrelin是近年來發(fā)現(xiàn)的一個由28個氨基酸組成的腦腸多肽，主

4、要來源于胃，是生長激素促泌素受體，研究證明Ghrelin及其受體存在于全身多處，決定其功能的多樣性，由于Ghrelin及其受體在肺組織的表達表明其可能具有治療肺部疾病的功能，研究者們對于Ghrelin功能進行了廣泛的研究，用Ghrelin治療膿毒癥誘導ALI成為新的研究熱點。最近在國外將Ghrelin應用于膿毒癥的相關研究中發(fā)現(xiàn)。Ghrelin可能通過NF-κB途徑降膿毒癥誘導ALI/ARDS小鼠血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6等

5、促炎因子，增加肺血流量，改善肺組織，減輕肺水，提高生存率。但國內仍沒有類似的報道，而且對于Ghrelin在治療膿毒癥上沒有提供一個最佳治療劑量，而Ghrelin治療ALI的纖溶作用只限于體外實驗。目前還沒有相關的動物實驗證實Ghrelin是否通過減低NF-κB介導TNF-α表達PAI-1，它在治療ALI機制還要進一步探討。因此，使用不同濃度Ghrelin對CLP介導肺損傷中細胞因子的調節(jié)效應，觀察其能否降低肺血管通透性，減輕肺損傷的嚴重

6、程度，尋找一個最佳治療組。同時，將觀察Ghrelin對NF-κB的表達和PAI-1、t-PA分泌是否有影響，探討其可能的作用機制。為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。 研究內容與方法： 第一部分：生長素釋放肽干預對CLP介導急性肺損傷小鼠的保護作用 1.隨機將昆明小鼠分為正常組（NS）、假手術組（Sham）、盲腸結扎穿孔組（CLP）和Ghrelin干預組（Ghrelin+CLP）；再將Ghrelin干預組分成5nmol

7、/kg、10nmol/kg、20nmol/kg、40nmol/kg、80nmol/kg五個劑量組，分別用A、B、C、D、E表示。而每個劑量組分別在CLP后5h、10h、15h時間段分次腹腔注射Ghrelin。 2.CLP組、Ghrelin干預組20h后處死小鼠、取樣，正常組、假手術組則給予腹腔注射生理鹽水（2.5 ml/kg）觀察20小時，處死小鼠，取樣，測定和比較各組的損傷指標，，包括肺濕/干重比值、肺水含量、肺組織水通道蛋白

8、測定，血清炎癥介質以及組織病理學評分，評估小鼠肺損傷，計算生存率。 第二部分：生長素釋放肽干預對CLP的機制——NF-κB信號通路和纖溶系統(tǒng) 1.免疫組化測定肺組織NF-κB的表達。 2.ELISA測定血漿PAI-1和t-PA水平，計算t-PNPAI-1比值。 結果： 第一部分：生長素釋放肽對CLP介導急性肺損傷小鼠的保護作用 1.Ghrelin干預對CLP誘導ALI/ARDS小鼠肺血管通

9、透性的影響 1.1.Ghrelin各干預組肺水含量顯著低于CLP組，Ghrelin干預C組肺水含量最少，但高于正常組和假手術組。Ghrelin干預C組肺濕/干重比值顯著低于CLP組，但較正常組和假手術組高。 1.2.Ghrelin干預C組水通道蛋白AQP1、AQP4的水平表達顯著高于CLP組，但低于正常組和假手術組。 1.3.CLP組肺組織學損傷評分明顯高于正常組和假手術組，達到ALI標準，Ghrelin干預C組

10、的肺組織病理顯示肺組織損傷較CLP減輕。 2.Ghrelin干預組對CLP誘導ALI小鼠血清炎癥介質的影響： ELISA結果顯示：Ghrelin干預組血清TNF-α水平均顯著低于CLP組，B組有統(tǒng)計學意義、C、D、E組有統(tǒng)計學意義，Ghrelin-C組IL-6，IL-1β水平均顯著低于CLP組，但較正常組和假手術組高。 3.Ghrelin干預組對CLP誘導ALI小鼠生存率的影響： CLP組在手術后7天

11、內全部死亡，與正常組、假手術組、Ghrelin-C組的平均生存時間明顯差別，Ghrelin-C組有3只小鼠存活生存時間超過10天，采用Kaplan-Meier Survival分析Ghrelin對CLP小鼠存活率的影響，與CLP組相比Ghrelin干預C組的存活時間則顯著延長，存活率顯著提高20％，Ghrelin干預CLP小鼠后生存率得到改善。 第二部分：生長素釋放肽干預對CLP的機制——NF-κB信號通路和纖溶系統(tǒng) 1

12、.免疫組化結果顯示：與正常組、假手術組相比，CLP組肺組織NF-κB表達顯著增強，Ghrelin干預C組的NF-κB表達強度比CLP組弱，與其減輕肺損傷相關。 2.ELISA結果顯示：與正常組、假手術組相比，CLP組t-PA水平輕度增高、PAI-1水平明顯增高，t-PA/PAI-1比值明顯下降，與ALI時纖溶抑制有關。與CLP組相比，Ghrelin-C組血漿t-PA水平輕度升高、PAI-1水平明顯下降、t-PA，PAI-1比值明