芒果苷對(duì)鉛暴露大鼠的保護(hù)作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、芒果苷是一種高效的抗氧化劑,且具有絡(luò)合、吸附及還原重金屬的功能,這些性質(zhì)使其緩解重金屬離子的毒害作用成為可能。
　　鉛是常見的環(huán)境污染物,可通過多種途徑進(jìn)入體內(nèi),造成機(jī)體多種器官系統(tǒng)的損害,中樞神經(jīng)系統(tǒng)是毒性作用的主要靶器官之一,兒童對(duì)鉛毒性尤為敏感,較低水平的鉛暴露即可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。已有研究表明,活性氧介導(dǎo)的氧化損傷參與鉛中毒的病理學(xué)過程。近年發(fā)現(xiàn)的紅系衍生核因子2相關(guān)因子和抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)通路具有

2、神經(jīng)保護(hù)作用。
　　本研究以鉛引起神經(jīng)組織氧化應(yīng)激為切入點(diǎn),利用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?應(yīng)用生物化學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)和方法來研究:
　?、倜⒐諏?duì)斷乳期鉛暴露大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力以及大腦皮層、海馬組織結(jié)構(gòu)的影響;對(duì)鉛暴露大鼠體內(nèi)鉛負(fù)荷的影響;
　?、诿⒐帐欠裢ㄟ^誘導(dǎo)Nrf2-ARE通路下游的相關(guān)酶參與改善鉛暴露大鼠的氧化損傷;
　　③Nrf2-ARE通路是否在芒果苷拮抗鉛致大鼠腦損害中發(fā)揮作用。主要研究結(jié)果如下

3、:
　　第一部分芒果苷對(duì)鉛暴露大鼠神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及體內(nèi)鉛負(fù)荷的影響
　　目的:研究芒果苷對(duì)鉛暴露大鼠神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及體內(nèi)鉛負(fù)荷的影響。
　　方法:將96只Wistar大鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(空白對(duì)照組)和鉛暴露組(以500ppm醋酸鉛溶液作為大鼠飲用水),染毒8周后,將鉛暴露后的大鼠再隨機(jī)分為5個(gè)組,以50、100和200mg/kg劑量的芒果苷(藥物組)和二巰基丁二酸(DMSA)組分別給其中四組大鼠灌胃,剩余一

4、組(鉛暴露模型組)給予等體積蒸餾水。給予芒果苷4周后,用Morris水迷宮進(jìn)行空間學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,脫頸椎處死動(dòng)物,采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)進(jìn)行鉛含量測(cè)定。HE染色,光鏡下觀察大腦皮層病理改變,TEM透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,鉛暴露模型組與空白模型組

5、相比,各統(tǒng)計(jì)指標(biāo)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。芒果苷治療組(200mg/kg)與鉛暴露模型組比,第三象限的停留時(shí)間較長(zhǎng),跨平臺(tái)次數(shù)較多,均有顯著性差異(p<0.05)。鉛暴露對(duì)斷乳期大鼠體重影響不明顯,但可引起海馬組織內(nèi)各種細(xì)胞超微病理結(jié)構(gòu)的變化,包括空泡化、線粒體腫脹、核濃縮和凋亡等,芒果苷治療組(100,200mg/kg)上述病理改變有很大改觀。大鼠斷乳期鉛暴露,可使大鼠血液及各臟器中鉛含量增加,芒果苷能使鉛負(fù)荷降低。其在骨和腦中的效果與DMSA

6、組相比沒有顯著性差異。
　　結(jié)論:鉛對(duì)本實(shí)驗(yàn)中斷乳期大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力沒有明顯影響,這可能和大鼠的神經(jīng)代償有關(guān);和空白組相比,芒果苷治療組(200mg/kg)能顯著提高大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力;芒果苷能改善斷乳期鉛暴露大鼠的病理?yè)p害,對(duì)鉛暴露大鼠有保護(hù)作用;芒果苷能降低血液及骨、腦、肝和腎鉛,這可能和它的螯合特性有關(guān);芒果苷能降低腦鉛,可能與它的分子量較小、較易穿透血腦屏障有關(guān)。
　　第二部分對(duì)血液和腦組織的氧化損傷的保護(hù)作

7、用
　　目的:研究芒果苷是否干預(yù)Nrf2-ARE通路所調(diào)控的抗氧化酶、II相解毒酶、谷胱甘肽及相關(guān)的調(diào)節(jié)酶。
　　方法:應(yīng)該商用試劑盒檢測(cè)H2O2、MDA含量以及Nrf2下游的抗氧化酶(SOD,CAT)活力、II相代謝酶(GST,NQO1,HO-1)活力、谷胱甘肽(GSH)調(diào)節(jié)酶類(γ-GCS,GR,GPx)以及GSH和GSSG的含量。
　　結(jié)果:鉛可以顯著提高脂質(zhì)過氧化物水平,降低抗氧化物酶活力。不同濃度的芒果苷治療

8、組可以顯著降低脂質(zhì)過氧化物水平,提高抗氧化物酶活力,其中200mg/kg芒果苷的作用最為明顯。鉛可以顯著抑制HO-1、NQO1酶,同時(shí)也抑制了GSH相關(guān)調(diào)節(jié)酶,GSH耗竭,GSH/GSSG比例下降。芒果苷治療組可以提高II相代謝酶以及谷胱甘肽調(diào)節(jié)酶類,提高GSH含量和GSH/GSSG比例,其中200mg/kg芒果苷的作用最為明顯。
　　結(jié)論:芒果苷治療各組可以提高機(jī)體氧化還原能力,提高大腦組織及血中Nrf2下游的II相代謝酶以及G

9、SH調(diào)節(jié)酶類活力,抑制由鉛誘導(dǎo)的氧化壓力,從而拮抗鉛誘導(dǎo)的損傷。以上研究結(jié)果提示Nrf2-ARE通路可能參與了芒果苷的氧化應(yīng)激防御機(jī)制。
　　第三部分Nrf2-ARE信號(hào)通路在芒果苷拮抗鉛致大鼠腦損害中的作用
　　目的:研究Nrf2-ARE通路是否在芒果苷拮抗鉛致大鼠腦損害中發(fā)揮作用。
　　方法:實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-

10、qPCR)、Western Blot,免疫組織化學(xué)檢測(cè)Nrf2、GCLM、GCLC以及HO-1 mRNA和蛋白表達(dá);Western-blot檢測(cè)Nrf2總蛋白和Nrf2核蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:RT-qPCR表明Nrf2 mRNA水平在鉛暴露大鼠有較弱的提高,在芒果苷治療各組也呈較弱的提高。γ-GCS和HO-1在鉛暴露大鼠中被抑制,在芒果苷治療各組中有顯著的提高,且呈劑量關(guān)系。免疫組化檢測(cè)顯示Nrf2在空白組未陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞,在鉛暴露

11、大鼠中陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞少量表達(dá),在芒果苷治療各組中表達(dá)大幅增加;γ-GCS陽(yáng)性細(xì)胞在鉛暴露大鼠中較空白組少,在芒果苷治療各組中表達(dá)大幅增加。
　　結(jié)論:Nrf2可被鉛激活,芒果苷可以進(jìn)一步激活它,其調(diào)控并非發(fā)生于基因轉(zhuǎn)錄水平,而可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的Nrf2入核和出核轉(zhuǎn)運(yùn)水平。Nrf2可能是芒果苷干預(yù)鉛暴露大鼠抗氧化基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。給予芒果苷后Nrf2的激活上調(diào)了其下游的γ-GCS、HO-1水平,提示Nrf2-ARE通路可能參

12、與了芒果苷的氧化應(yīng)激防御機(jī)制。
　　綜上所述,我們可以得出如下結(jié)論:芒果苷能減輕鉛暴露大鼠的氧化損傷,對(duì)鉛暴露大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用;這種神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過激活Nrf2-ARE通路誘導(dǎo)下游抗氧化/解毒酶等基因的表達(dá)從而抑制氧化損傷來實(shí)現(xiàn)的;以Nrf2-ARE通路的藥物治療對(duì)鉛中毒大鼠的防治具有良好的應(yīng)用前景。Nrf2/ARE信號(hào)通路示意圖及芒果苷的可能作用機(jī)制見圖1。
　　本研究的創(chuàng)新之處:將強(qiáng)抗氧化劑芒果苷應(yīng)用于重金屬鉛的