ChM—Ⅰ和CTGF蛋白在MSCs和軟骨細(xì)胞中的差異表達(dá).pdf

1、背景和目的：軟骨是耳鼻喉科最為常用、最為重要的移植、修復(fù)支架材料之一。軟骨一旦破壞，自身修復(fù)能力極弱?，F(xiàn)在臨床上使用的移植、修復(fù)材料還不夠完善，因此，組織工程軟骨的相關(guān)研究正成為本學(xué)科的熱點(diǎn)。其中因細(xì)胞因子對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、分化的關(guān)鍵作用而成為本領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。 本課題組的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)利用基因芯片與生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和透明軟骨及彈性軟骨細(xì)胞的差異表

2、達(dá)基因進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示軟骨調(diào)節(jié)素(chondromodulin，ChM)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)基因在軟骨細(xì)胞中高表達(dá)，提示這兩個(gè)基因可能在軟骨形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能是誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因。本實(shí)驗(yàn)對(duì)軟骨調(diào)節(jié)素-I(chondromodulin-I，ChM-I)和CTGF在MSCs、透明軟骨細(xì)胞及彈性軟骨細(xì)胞中的差異表達(dá)用Western blo

3、t進(jìn)行了蛋白質(zhì)水平的驗(yàn)證，為下一步實(shí)驗(yàn)選擇準(zhǔn)確的生物因子來(lái)定向誘導(dǎo)MSCs分化為軟骨細(xì)胞奠定理論基礎(chǔ)。 方法：通過(guò)密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法的聯(lián)合應(yīng)用提取SD大鼠的MSCs，酶消化法得到肋軟骨透明軟骨細(xì)胞和耳廓彈性軟骨細(xì)胞，分別培養(yǎng)2-3代后提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)ChM-I和CTGF蛋白水平的表達(dá)，并進(jìn)行定量分析。 結(jié)果： 1、密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法能分離出較為純化的MSCs，細(xì)胞大都呈

4、梭形貼壁生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀測(cè)定其細(xì)胞表型結(jié)果符合MSCs的特性。 2、Western blot定量分析表明：(1)透明軟骨細(xì)胞中ChM-I蛋白的表達(dá)明顯高于MSCs(P<0.05)，彈性軟骨細(xì)胞中ChM-I蛋白的表達(dá)也明顯高于MSCs(P<0.05)，而透明軟骨細(xì)胞和彈性軟骨細(xì)胞中ChM-I蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。(2)透明軟骨細(xì)胞中CTGF蛋白的表達(dá)明顯低于MSCs(P<0.05)，彈性軟骨細(xì)胞中CTGF蛋白的表

5、達(dá)也明顯低于MSCs(P<0.05)，而透明軟骨細(xì)胞和彈性軟骨細(xì)胞中CTGF蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1、密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法能有效分離純化大鼠MSCs。 2、ChM-I蛋白的表達(dá)與ChM-I基因的表達(dá)相一致。ChM-I蛋白在軟骨細(xì)胞中的高表達(dá)說(shuō)明ChM-I可能在MSCs向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中起定向誘導(dǎo)作用，提示ChM-I可作為定向誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化的重要備選生物因子。