硫酸軟骨素蛋白多糖在神經(jīng)前體細胞及其分化細胞中的表達和調(diào)控.pdf

1、神經(jīng)前體細胞 (NPCs) 存在于胚胎以及成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS)，是一群具有自我更新、自我增殖和多向分化潛能的細胞。近年來，有關NPCs的研究已成為神經(jīng)生物學領域的研究熱點，因為它既是研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)細胞分化的良好載體，又是治療CNS損傷以及退行性疾病最理想的供體細胞來源之一。研究發(fā)現(xiàn)CNS的細胞外基質(zhì) (ECM) 在體內(nèi)NPCs的分化和發(fā)育過程中發(fā)揮著相當重要的調(diào)節(jié)功能，近年來還有證據(jù)表明這種調(diào)節(jié)功能可以通過激活

2、integrins信號通路來實現(xiàn)，其中還包括MAP激酶通路的參與。 硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs) 是CNS細胞外基質(zhì)中的重要成分，在神經(jīng)細胞的分化和發(fā)育過程中發(fā)揮極其重要的調(diào)控功能。它們在發(fā)育期時充當軸突生長的導向分子，限制軸突向不合適的方向延伸；成年后參與形成神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡來調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性；而在CNS損傷后，則作為膠質(zhì)瘢痕中的重要成分，阻礙受損軸突的再生和殘余神經(jīng)元的代償性生長。然而，目前對于CSPGs在NPCs發(fā)育

3、過程中的表達以及相應的生理功能還知之甚少。 本文第一部分研究的主要目的是了解CSPGs對NPCs增殖、遷移和分化等生物學特性的影響及其可能的作用機制，為研究CSPGs在CNS中的生物學功能提供新的線索，同時也為NPCs移植用于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及CNS損傷的臨床治療提供一些新的思路。 在研究中，首先運用雙重免疫熒光染色證實來源于E16胚胎大鼠腦的NPCs組成性表達CSPGs；然后應用硫酸軟骨素酶Chondroitinas

4、e ABC (Chase ABC)，選擇性降解連接在CSPGs核心蛋白上的糖氨多糖鏈，破壞內(nèi)源性CSPGs的功能，觀察NPCs在增殖、遷移和分化等諸多生物學特性方面的變化，由此推測內(nèi)源性CSPGs對NPCs生物學特性的影響。 結果發(fā)現(xiàn)： (1) 加入Chase ABC后，NPCs仍可分裂增殖，但細胞的粘附性增加，由懸浮成球生長轉變?yōu)橘N壁生長，形成不規(guī)則的細胞團塊，一些細胞從神經(jīng)球中向外遷移，其胞體上出現(xiàn)小而不規(guī)則的突起，

5、呈現(xiàn)一定分化趨勢，這些變化提示CSPGs對維持NPCs細胞球的形態(tài)有重要作用。 (2) [3H]同位素摻入實驗證明一定濃度范圍內(nèi)的Chase ABC處理可以使NPCs呈現(xiàn)明顯的劑量非依賴性[3H]摻入量增加，與對照組相比，增幅約為19-20％ (P<0.05)。而流式細胞術對細胞周期的分析結果顯示Chase ABC處理除了引起G2-期細胞下降外 (P<0.05)，G1-期、S-期細胞以及擴增指數(shù) (PI) 都沒有明顯差異。上述結

6、果提示，Chase ABC處理不改變NPCs的細胞周期，但由于神經(jīng)球立體構象和生長形態(tài)發(fā)生改變，使每個進入增殖周期的細胞都容易攝入同位素標記的核苷酸用于DNA合成，因而從整體水平上促進了NPCs的增殖。 (3) 應用免疫熒光染色和流式細胞術證明，在含有神經(jīng)生長因子的增殖環(huán)境中，Chase ABC處理不影響NPCs特征性標志Nestin的表達，但增加了星型膠質(zhì)細胞分化標志GFAP的表達，這一點與細胞形態(tài)上的分化趨勢相吻合。這些結果

7、提示，CSPGs不僅參與維持NPCs細胞球的形態(tài)，還有利于它們保持前體細胞的未分化狀態(tài)。 (4) 神經(jīng)球的遷移實驗結果顯示，在選定的3個時間點，Chase ABC處理明顯促進了NPCs的遷移，表明CSPGs對NPCs的遷移有一定的限制作用。 (5) 在含有1％ FBS的分化環(huán)境中，通過免疫熒光染色和western blot分析，證明Chase ABC處理顯著改變了NPCs的體外分化格局和分化細胞的形態(tài)，如：增加了β-II

8、I tubulin+神經(jīng)元的分化比例，而且從單個神經(jīng)元上延伸出的突起總長度更長，結構更復雜；GFAP+的星型膠質(zhì)細胞比例明顯降低，且多數(shù)為胞體呈星型，突起細長且具有高度分支結構的類似II型星型的膠質(zhì)細胞；少突膠質(zhì)細胞形態(tài)更趨成熟，而且成熟分化標志－髓鞘堿性蛋白 (MBP) 的表達量明顯增加，這些結果表明CSPGs是NPCs分化的重要調(diào)控因素。 (6) 整合素integrins功能封閉實驗證明，Echistatin (integr

9、ins功能抑制劑)可以阻斷Chase ABC處理所引起的NPCs細胞球生長形態(tài)改變和少突膠質(zhì)細胞更趨成熟的效應。這些結果表明integrins信號通路參與了CSPGs對NPCs生物學特性的調(diào)節(jié)。 哺乳動物的CNS中包含種類眾多的CSPGs，它們在發(fā)育過程中具有獨特而復雜的時空表達模式，Versican就是其中一類廣泛存在于CNS中的大分子CSPGs，它最早是從人的成纖維細胞和發(fā)育中的雞胚肢芽中分離得到，后來又發(fā)現(xiàn)在正常CNS以及

10、大腦腫瘤中都有表達。Versican具有高度的反應活性，在發(fā)育和疾病的眾多關鍵環(huán)節(jié)發(fā)揮重要功能。結構上，它由N-端的G1區(qū)、硫酸軟骨素 (CS) 結合區(qū)以及C-端G3區(qū)這三大部分組成，其CS結合區(qū)由2個外顯子編碼，經(jīng)mRNA水平剪接，Versican可產(chǎn)生4種異構體，其中 V0包含CSα和CSβ區(qū)，V1和V2分別具有CSβ區(qū)或CSα區(qū)，V3則兩者都不具備。在大腦發(fā)育過程中，VersicanV1/V0和V2具有互補的表達模式，前者主要見于

11、胚胎發(fā)育的晚期階段，后者則多見于成熟大腦中，這種迥異的表達格局可能反映了它們在體內(nèi)生理功能的差異。 此外，體內(nèi)細胞外基質(zhì)的組成并不是一成不變的，諸多生理和病理過程都會影響它們的構成和功能，而細胞因子就是其中一種重要的調(diào)控因素，如轉化生長因子(TGF-β)、白介素-1β (IL-1β) 以及腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 等。研究發(fā)現(xiàn)成年的CNS損傷后，大量細胞因子被釋放到損傷局部，促進了反應性膠質(zhì)增生和膠質(zhì)瘢痕的形成，限制了軸

12、突的再生。文獻報道CNS損傷后，Versican的表達上調(diào)，而且主要分布于抑制軸突再生的微環(huán)境中，但目前研究人員并不完全清楚損傷或者致炎因子究竟是如何對功能各異的Versican異構體的表達進行調(diào)控的。 本文第二部分研究的主要目的就是觀察Versican及其異構體在NPCs及其分化過程中的表達規(guī)律以及炎癥因子對Versican基因表達的調(diào)控。 研究發(fā)現(xiàn)： (1) 免疫熒光雙重染色結果顯示，Versican在Nes

13、tin+的NPCs及其分化的GFAP+的星型膠質(zhì)細胞、βIII-tubulin+的神經(jīng)元和Rip+的少突膠質(zhì)細胞 (Ols)中都有組成性表達。 (2) 建立了一種定向誘導NPCs分化為少突膠質(zhì)前體細胞 (OPCs)，并使其進一步分化為成熟少突膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)模型，該模型能模擬體內(nèi)少突膠質(zhì)細胞的發(fā)育分化過程。結果發(fā)現(xiàn)，從OPCs到成熟Ols的體外分化過程中，早期分化標志A2B5的表達迅速減少，而一些更加成熟的分化標志，如O4,

14、O1 以及MBP的表達則逐漸增加。 (3) 通過免疫熒光雙重染色觀察Versican在少突膠質(zhì)細胞各分化階段的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)在A2B5+的OPCs、O4+的前少突膠質(zhì)細胞、 O1+的未成熟少突膠質(zhì)細胞以及MBP+的成熟少突膠質(zhì)細胞的胞體和突起表面都有Versican的表達。 (4) 通過RT-PCR從mRNA水平比較了Versican V1/V0以及V2在NPCs以及Ols的3個不同分化階段（OPCs、分化4天、分化

15、14天）的表達格局，結果發(fā)現(xiàn)：Versican V1/V0在NPCs中表達最低 (P<0.01)，至OPCs時表達上調(diào)至原先的1.42倍，并在隨后的分化中維持較高的表達水平；Versican V2在NPCs中表達也較低，其峰值出現(xiàn)在OPCs階段，表達量約為NPCs時的2.13倍 (P<0.01)，然后就逐漸下降，至分化14天時已接近NPCs 的表達水平 (P>0.05)。 (5) 建立Real-time PCR檢測體系，從mRN

16、A水平半定量觀察兩種炎癥因子—腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 和γ-干擾素 (IFN-γ) 對NPCs中Versican不同異構體基因表達的影響，結果顯示：TNF-α和IFN-γ單獨或者合并使用，不影響NPCs中Versican V1/V0的表達，但以劑量依賴的方式上調(diào)了VersicanV2的表達，二者的合并作用對Versican V2的表達調(diào)節(jié)還具有一定累加效應。 結論： (1) CSPGs參與了對NPCs增殖、遷移