伊文氏藍血管顯影方法及其在脊髓損傷中的應用.pdf

1、脊髓損傷往往會導致患者的終生殘疾，給患者、家庭和社會帶來痛苦和負擔，目前臨床上仍沒有良好的治療方法，所以對脊髓損傷的病理機制和治療方法是研究的難點和重點。脊髓損傷的病理過程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷對細胞和組織造成機械性損傷，并向周圍組織滲出各種有害因子，具有細胞毒性作用，引發(fā)繼發(fā)性損傷，并沿著脊髓縱軸向頭尾兩端擴展，形成數倍于原發(fā)性損傷的壞死區(qū)。所以繼發(fā)性損傷的形成機制、病理變化以及減輕繼發(fā)性損傷的方法成為極其重要的研究課

2、題。脊髓損傷過程中，缺血是重要的病理機制，因為血流量的降低會加重脊髓的損傷。為了研究脊髓繼發(fā)性損傷中的缺血問題，有效顯示血管并結合免疫組織化學研究的血管顯影方法是必要的研究手段。 目前常用的血管顯影方法有墨汁灌注法，免疫組織化學方法，單寧酸媒染法，酶組織化學法等等，但這些方法各有弊端，如不能與免疫組織化學研究相結合，過程繁瑣或熒光易淬滅等。本實驗采用伊文氏藍進行血管顯影，伊文氏藍是一種熒光染料，在白光下呈藍色，在熒光顯微鏡綠色激

3、發(fā)光下呈鮮紅色，用于研究血腦屏障通透性的改變。它可與血漿白蛋白結合形成伊文氏藍-白蛋白復合體，再與血管內皮細胞膜上的血漿白蛋白受體結合，因此理論上應該可以通過灌注方法顯示血管形態(tài)。 本實驗分為兩部分。第一部分為伊文氏藍血管顯影方法的建立。實驗動物為C57BL/6小鼠和SD（Sprague-Dawley）大鼠。其中C57BL/6小鼠12只，分為空白對照組，正常灌注固定組。正常灌注固定組小鼠經股靜脈注射伊文氏藍后（空白對照組注射生理

4、鹽水），灌注生理鹽水和多聚甲醛，冰凍切片三套，一套直接100％酒精脫水透明，中性樹膠封片，一套HE染色，一套免疫組化檢測GFAP。SD大鼠15只，分為正常組伊文氏藍灌注后固定組和正常組伊文氏藍灌注前固定組。其中灌注后固定組又分為空白對照組，正常灌注固定組，顯影過程類似于小鼠。灌注前固定組又分為5％明膠伊文氏藍組，明膠-鉻明礬-伊文氏藍-白蛋白組（簡稱明-鉻-藍組），對正常大鼠灌注生理鹽水和多聚甲醛后，分別注射配制的兩種造影溶液，待明膠凝

5、固后進行取材，冰凍切片后直接100％酒精脫水透明，中性樹膠封片，或進行免疫組織化學研究。結果表明，正常C57BL/6小鼠注射5％伊文氏藍0.5ml時，能夠清晰地觀察到脊髓內的血管。SD大鼠正常組伊文氏藍灌注后固定組中注射8％伊文氏藍5ml時，能夠清晰地觀察到脊髓內血管的形態(tài)分布；正常組伊文氏藍灌注前固定組中，SD大鼠灌注后注射5％明膠伊文氏藍溶液時血管填充充分，輪廓清晰，而明-鉻-藍組可以顯示血管的同時進行免疫組織化學復染。 第

6、二部分將建立的血管顯影方法用于脊髓損傷的研究。實驗動物為SD大鼠，損傷2周后分別采用大鼠灌注后固定組和灌注前固定組方法進行血管顯影，冰凍切片并進行免疫組織化學研究。結果顯示，灌注后固定組可觀察損傷區(qū)與正常組織交界部位的血管結構以及血-脊髓屏障破壞情況，相鄰切片可進行免疫組織化學研究。灌注前固定組中顯影液為5％明膠伊文氏藍時，血管形態(tài)清晰，鄰近損傷區(qū)伊文氏藍彌散很少，而顯影液為GCEA灌注液時，能夠顯示血管并進行免疫組織化學復染，但血管形