Numb蛋白家族在心臟發(fā)育中的作用.pdf

1、研究背景及研究目的：
　　脊椎動物心臟是在胚胎發(fā)育過程中最早形成并發(fā)揮功能的器官。心臟發(fā)育是一個極其精準而復雜并且時空相關(guān)的過程，其間涉及一系列關(guān)鍵事件的發(fā)生，這些關(guān)鍵事件受多條信號通路在時間和空間上的精準調(diào)控，任何環(huán)節(jié)調(diào)控失衡都將會影響心臟功能的正常發(fā)揮并誘發(fā)先天性心臟病。
　　Numb家族蛋白（NFPs）是一個細胞命運決定子，其家族包括Numb和Numblike（Numbl）。最新研究表明NFPs缺失導致小鼠胚胎流出道形

2、成缺陷，暗示NFPs在流出道發(fā)育過程中的重要作用，但其機制尚不明確。同時，我們還發(fā)現(xiàn)在Numb和Numbl雙基因敲除的胚胎心臟中，Notch1信號通路被異位激活，暗示NFPs在心臟發(fā)育過程中的功能可能依賴Notch1信號通路。我們通過應(yīng)用Cre-loxp系統(tǒng)在心肌祖細胞中特異性敲除Numb、Numbl和Notch1得到Numb、Numbl雙重基因敲除胚胎和Numb、Numbl、Notch1的三重基因敲除胚胎，探討Notch1信號通路與N

3、FPs在心臟發(fā)育過程中的關(guān)系。在研究過程中，我們還發(fā)現(xiàn)，在Numb、Numbl雙重基因敲除胚胎的心臟中，Hey2的表達發(fā)生改變，因此我們對影響Hey2在心臟中的表達水平和表達模式的信號通路進行了深入的研究和探索1。
　　本研究將在一定程度上闡明NFPs在心臟流出道形成過程中的功能及其調(diào)控機制并確定NPFs在心臟小梁的形成過程中如何依賴Notch1信號通路發(fā)揮作用，同時闡明Hey2在心臟發(fā)育過程中的時空表達方式，將有助于人們進一步認

4、識了解先天性心臟病，為其治療和干預提供研究基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　1.特異性基因敲除小鼠的建立：我們通過Cre-loxp系統(tǒng)建立所需要的特異性基因敲除胚胎。我們通過心臟特異性表達的Nkx2.5cre/+、心內(nèi)膜特異性表達的Nfatc1cre/+和內(nèi)皮細胞特異性表達Tie2-cre分別對心肌細胞、心內(nèi)膜細胞和內(nèi)皮細胞中的靶基因進行特異性敲除2。
　　2.mRNA deep sequencing和Protein arr

5、ay分析：通過收集對照組和突變組胚胎心臟樣品進行mRNA deep sequencing和Protein array分析，對結(jié)果進行分析篩選并結(jié)合文獻報道，確定有表達差異的基因及對應(yīng)的信號通路。
　　3.機制分析：
　?。?）利用免疫熒光染色及RNA原位雜交技術(shù)驗證相關(guān)基因蛋白和mRNA表達水平及表達方式。
　?。?）通過Western Blot和Q-PCR進一步驗證相關(guān)基因的蛋白和mRNA表達水平。
　?。?）

6、通過小鼠胚胎體內(nèi)給予FGF2刺激和胚胎體外培養(yǎng)并進行FGF2刺激以驗證相關(guān)信號通路對Hey2表達水平和表達模式的影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1.通過EdU標記檢測流出道心肌細胞的增殖，發(fā)現(xiàn)流出道心肌細胞的增殖具有空間差異性，表現(xiàn)為左右兩側(cè)的心肌細胞不均等增殖，在 NFPs缺失的情況下，這種表型被打破。
　　2.NFPs缺失的情況下導致Pitx2表達降低，并且在流出道的表達模式發(fā)生變化。
　　3.NFPs缺失導致心

7、臟神經(jīng)嵴細胞數(shù)量減少，其原因和MDKO中心臟神經(jīng)嵴細胞的增殖降低有關(guān)。
　　4.NFPs缺失導致第二生心區(qū)祖細胞增多，且排列紊亂。
　　5.心肌細胞Notch1敲除能夠部分挽救Numb、Numbl雙基因敲除所導致的小梁形成缺陷。
　　6.心肌細胞Notch1敲除能夠部分降低Numb、Numbl雙基因敲除所導致的小梁區(qū)心肌細胞過度增殖。
　　7.Notch1/β-catenin/Isl1信號通路在NFPs缺失情況下

8、上調(diào)，在Numb、Numbl、Notch1三重基因敲除的心臟中下調(diào)。
　　8.Hey2在心臟發(fā)育中的表達具有時間和空間特異性。
　　9.Notch、Nrg/ErbB2,4和YAP信號通路在心臟發(fā)育過程中能夠調(diào)控Hey2表達水平，但不調(diào)控其表達模式。
　　10.FGF信號通路在心臟發(fā)育過程中調(diào)控Hey2的表達水平和表達模式。
　　結(jié)論：
　　1.NFPs通過影響Nodal-Pitx2信號通路調(diào)控流出道心肌細胞