泛素基因家族在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中的功能分析.pdf

1、泛素-蛋白酶體是普遍存在于生物體各組織內(nèi)的蛋白降解通路，它參與了幾乎所有動(dòng)植物體的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化；細(xì)胞周期調(diào)控；膜受體內(nèi)吞作用；基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)等方面，它能通過(guò)降解其他通路的抑制因子或激活因子從而調(diào)控通路的進(jìn)程。為了研究該通路在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中的功能，本研究克隆驗(yàn)證了28泛素家族基因的開(kāi)放閱讀框，其中包括1個(gè)泛素前體、5個(gè)泛素類(lèi)似物、2個(gè)泛素活化酶、14個(gè)泛素結(jié)合酶、3個(gè)泛素連接酶和3個(gè)泛素羧基末端水解酶。利用熒光定

2、量PCR技術(shù)檢測(cè)了這28個(gè)基因在斑節(jié)對(duì)蝦性腺不同發(fā)育時(shí)期的卵巢和肝胰腺中的表達(dá)，結(jié)果顯示在卵巢發(fā)育中各基因的表達(dá)趨勢(shì)大體上分為三支，有8個(gè)基因的表達(dá)總趨勢(shì)上升（UBE3S、UBE2N、UBFD1、UBE2G1、UBE2J2、UFM、UFM1、UBE2H1）；7個(gè)基因的表達(dá)總趨勢(shì)下降（UMAE5、UBE、UPL、UCHIL5、UBS30、UDCP2、ULP3）；10個(gè)基因的表達(dá)呈先升后降的趨勢(shì)（UCH14、UBE2V2、UBE2Q1、UB

3、E2A、UBE2G2、UBA1、UBE2H、UBE3B1F1、UBE2C、UBE2H5b）。各基因在卵巢不同發(fā)育期對(duì)應(yīng)的肝胰腺中的表達(dá)結(jié)果顯示基因的表達(dá)趨勢(shì)大體上分為三支，有12個(gè)基因的表達(dá)總趨勢(shì)先降后升（UBE3S、UBE2N、UFM、UBFD1、UBE、UBE2A、UPL、UBE2G1、UBA1、UBE3B1F1）；2個(gè)基因的表達(dá)總趨勢(shì)上升（UBE2V2、UBE2H1）;14個(gè)基因的表達(dá)呈先降后升,再降的趨勢(shì)（UCH14、UBE2Q

4、1、UBE2G2、UBE2H、UBE2C、UBE2H5b、UMAE5、UCHIL5、UBS30、UDCP2、ULP3、UBE2J2、UFM1、UBE2）。
　　根據(jù)結(jié)果篩選出泛素前體（UBS30）、泛素活化酶 E1（UBA1）、泛素結(jié)合酶 E2（UBE2A、UBE2G1、UBE2G2和 UBE2H）6個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白功能分析。PmUBS30全長(zhǎng)為933 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?96 bp，編碼131個(gè)氨基酸；熒光定量PCR結(jié)果顯

5、示該基因在胃中表達(dá)量最高，心臟次之；構(gòu)建體外重組表達(dá)體系，1mmol/L IPTG、25℃誘導(dǎo)6小時(shí)可得到33.5kD左右目的條帶，Western Blot驗(yàn)證目的條帶后進(jìn)行蛋白純化，蛋白濃度為3.13μg/μl。PmUBA1全長(zhǎng)為3822 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?120 bp，編碼1039個(gè)氨基酸；熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因在淋巴器官和胃中表達(dá)量最高，鰓次之；構(gòu)建體外重組表達(dá)體系1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時(shí)可得到其核心區(qū)域

6、約為34kD的目的條帶，Western Blot驗(yàn)證目的條帶后進(jìn)行蛋白純化，濃度為3.20μg/μl；利用重組蛋白制備多克隆抗體，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示UBA1在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢不同發(fā)育時(shí)期中的卵巢中主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，且在III期、IV期、V期卵巢中表達(dá)較為明顯，I期和II期卵巢中無(wú)明顯表達(dá)。PmUBE2A全長(zhǎng)為941 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?98 bp，編碼165個(gè)氨基酸；熒光定量 PCR結(jié)果顯示該基因在淋巴器官表達(dá)量最高，胃組織次之，其次是

7、鰓、心臟；1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時(shí)可得到其核心區(qū)域約為38kD的目的條帶，Western Blot驗(yàn)證目的條帶后進(jìn)行蛋白純化，濃度約為2.08μg/μl。PmUBE2G1全長(zhǎng)為911 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?01bp，編碼166個(gè)氨基酸；熒光定量結(jié)果顯示該基因在淋巴器官、鰓組織和胃組織中表達(dá)量最高，心臟次之；1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時(shí)可得到其核心區(qū)域約為38kD的目的條帶，Western Blot驗(yàn)證目的條

8、帶。PmUBE2G2得到片段長(zhǎng)為620 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?07 bp，編碼168個(gè)氨基酸；熒光定量 PCR結(jié)果顯示該基因在淋巴器官和胃中表達(dá)量最高，肝胰腺次之，與鰓和心臟組織的差異不顯著；1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時(shí)可得到其核心區(qū)域約為38kD的目的條帶，Western Blot驗(yàn)證目的條帶后進(jìn)行蛋白純化，濃度約為2.66μg/μl。PmUBE2H得到片段長(zhǎng)為1010 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?55 bp，編碼184個(gè)氨基酸；

9、熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因在淋巴器官表達(dá)量最高，鰓次之；1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時(shí)可得到其核心區(qū)域約為39kD的目的條帶，Western Blot驗(yàn)證目的條帶后進(jìn)行蛋白純化，濃度約為2.92μg/μl。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究泛素家族基因在斑節(jié)對(duì)蝦性腺不同發(fā)育時(shí)期的卵巢和肝胰腺中的表達(dá)，推斷這些基因分別參與斑節(jié)對(duì)蝦卵巢卵母細(xì)胞分化及卵黃蛋白積累，同時(shí)參與肝胰腺卵黃蛋白原的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)。并篩選6個(gè)各類(lèi)基因進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白