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1、第一部分 目的:觀察脂肪酸結(jié)合蛋白(Fat acid binding protein-3,F(xiàn)ABP3)基因在畸胎瘤細胞P19細胞向心肌細胞誘導(dǎo)分化過程中表達水平的變化,探討FABP3基因與心肌細胞分化之間的關(guān)系。 方法:P19細胞經(jīng)1%二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)4天(d4)形成細胞聚集體,將聚集體用生長培養(yǎng)基粘附培養(yǎng)至第15天(d15),觀察細胞跳動情況;用肌鈣蛋白I(cTnI)抗體行western blot,鑒
2、定心肌細胞分化;采用RT-PCR、Western Blot技術(shù),在細胞分化成熟的不同時段檢測P19細胞中FABP3基因mRNA和蛋白的表達水平。 結(jié)論:FABP3基因可能參與心肌細胞的分化。 第二部分:FABP3基因過表達對P19細胞向心肌細胞分化的影響 目的:觀察脂肪酸結(jié)合蛋白FABP3基因過表達(overexpression)在胚胎癌細胞P19細胞向心肌細胞誘導(dǎo)分化過程中對細胞分化的影響,探討FABP3基因與
3、心肌細胞分化之間的關(guān)系。 方法:構(gòu)建FABP3基因的綠色熒光載體及過表達載體,轉(zhuǎn)染P19細胞后,以1%二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)分化,用熒光顯微鏡和激光共聚焦檢測FABP3的亞細胞定位;將FABP3基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P19細胞,用MTT法檢測細胞增殖,用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡,并采用RT-PCR技術(shù)在細胞分化成熟的不同時段檢測P19細胞中心肌分化標志基因cTnT、alpha-MHC、GATA4、MEF2c的mRNA表達水平。
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