大鼠心肌細(xì)胞分離和基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平是心臟病領(lǐng)域的重要研究方法,幫助認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)病機(jī)制。傳統(tǒng)研究所用的對(duì)象多是心肌組織,但是在正常的心室壁組織中,除心肌細(xì)胞外,還有成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及其它類(lèi)型細(xì)胞,這些細(xì)胞存在會(huì)對(duì)分析心肌細(xì)胞基因表達(dá)水平造成很大的干擾。所以我們更需要分離心肌細(xì)胞后再進(jìn)行基因表達(dá)分析。既往許多研究者設(shè)計(jì)過(guò)不同的分離心肌細(xì)胞的方法,但均有各種的不足,如對(duì)于操作技術(shù)、設(shè)備要求較高、分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、細(xì)胞得出量較少等。酶解法是一種常用的分

2、離心肌方法,但技術(shù)操作細(xì)節(jié)的差異使其分離的結(jié)果不盡一致,且尚無(wú)對(duì)于分離后提取RNA進(jìn)行基因表達(dá)分析的效果進(jìn)行詳細(xì)的研究。本文將對(duì)該方法進(jìn)行深入研究,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析,為進(jìn)一步使用純化的心肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平研究提供基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　 方法:對(duì)8周雄性SD大鼠的心臟應(yīng)用Langendorff灌流酶解法進(jìn)行心肌細(xì)胞分離純化,分離得到的細(xì)胞進(jìn)行普通光學(xué)顯微鏡觀察并細(xì)胞計(jì)數(shù)；吖啶橙染色后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；提取總RNA后應(yīng)用分光光

3、度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)RNA完整指數(shù)(RNA integrity number,RIN)的方法檢測(cè)RNA完整性；用Real-time RT-PCR的方法檢測(cè)心肌組織中三種細(xì)胞特異性標(biāo)志的相對(duì)表達(dá)量:肌鈣蛋白T(TnT,心肌細(xì)胞)、波形蛋白(Vim,成纖維細(xì)胞)和平滑肌α肌動(dòng)蛋白(α-SMA平滑肌細(xì)胞),作為內(nèi)參的看家基因分別為肽脯氨酰異構(gòu)酶A(PPIA)和核糖體蛋白(RPLP0)。此外選用2周齡、3周齡和8周齡的雄性Wistar大鼠進(jìn)

4、行心肌細(xì)胞分離,分離后提取RNA,用Real-time RT-PCR的方法檢測(cè)心肌組織中腺嘌呤核苷酸易位酶(ANT)的兩種亞型ANT-1和ANT-2的表達(dá)量,內(nèi)參基因選擇PPIA。
　　 結(jié)果:整個(gè)心肌分離過(guò)程大約需要30分鐘左右,可以得到比較好的心肌產(chǎn)出率,普通光學(xué)顯微鏡下觀察絕大部分細(xì)胞形態(tài)完整呈桿狀,有明顯的橫紋,吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下觀察亦可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞核被染成明亮的綠色,而細(xì)胞外的背景幾乎沒(méi)有熒光產(chǎn)生。將形

5、態(tài)典型的心肌細(xì)胞記為心肌細(xì)胞,其它均作為不典型細(xì)胞,3只大鼠的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果n心肌細(xì)胞/n所有細(xì)胞分別為:87.3±3.2％,91.8±5.1％,88.1±3.3％。提取的總RNA的A260/280在1.8-2.0之間,符合Real-time RT-PCR需要的RNA純度；電泳結(jié)果提示RNA沒(méi)有明顯的降解,與心肌組織提取的RNA無(wú)明顯差異(n=3)；RIN值在7-8之間,亦適于進(jìn)行Real-time RT-PCR,與心肌組織提取的RNA無(wú)

6、明顯差異(n=6,P>0.05)。通過(guò)Real-time RT-PCR檢測(cè)TnT、Vim和α-SMA相對(duì)于PPIA和RPLP0的表達(dá)量,均為經(jīng)過(guò)分離Vim和α-SMA的表達(dá)量顯著下降,而TnT的表達(dá)量顯著上升(n=6,P<0.05),三者的變化倍數(shù)分別為0.38、0.16、2.56(PPIA作為內(nèi)參)和0.35、0.17、2.33(RPLP0作為內(nèi)參)。ANT-1在心肌細(xì)胞中的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于ANT-2(10±1.3倍,n=6),高的倍數(shù)

7、比之前文獻(xiàn)報(bào)道(以心肌組織作為樣本)的結(jié)果要更顯著,ANT-1和ANT-2在心肌發(fā)育過(guò)程中(2周、3周和12周)表達(dá)量的變化(n=6)也與之前文獻(xiàn)報(bào)道(以心肌組織作為樣本)有所差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過(guò)對(duì)既往文獻(xiàn)的總結(jié),完善了Langendorff灌流酶解分離大鼠心肌細(xì)胞的方法,提純度可達(dá)90％,細(xì)胞產(chǎn)量較高,適于提取RNA進(jìn)行進(jìn)一步研究；
　　 2.該方法在分離過(guò)程中RNA沒(méi)有明顯的降解,適用于心肌基