雛雞心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及錳對(duì)肉仔雞心肌細(xì)胞MnSOD基因表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、MnSOD是動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化劑，能催化分解生物體氧化過程中產(chǎn)生的有毒物O2-·為O2和H2O2，從而防治多種與之有關(guān)的疾病，具有抗氧化應(yīng)激和抗癌的功能。肉仔雞的生長(zhǎng)發(fā)育快，體內(nèi)代謝比較旺盛，代謝過程中產(chǎn)生的有毒O2-·較多，尤其是在心臟等代謝旺盛的器官。MnSOD是肉仔雞體內(nèi)一種重要O2-·清除劑，在肉仔雞抗氧化應(yīng)激體系中起關(guān)鍵作用，而錳作為MnSOD的組成部分，對(duì)MnSOD基因的表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要作用。本研究采用體外法研究錳對(duì)肉仔

2、雞心肌細(xì)胞MnSOD基因的表達(dá)調(diào)控作用。研究分為三個(gè)部分：(1)雛雞心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)；(2)錳對(duì)肉仔雞心肌細(xì)胞MnSOD活性的影響；(3)錳對(duì)肉仔雞心肌細(xì)胞MnSOD mRNA表達(dá)的影響。 1.采用組織貼塊法和酶消化法結(jié)合差速貼壁法培養(yǎng)肉仔雞心肌細(xì)胞，并對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色以鑒定是否為心肌細(xì)胞。分別應(yīng)用胰蛋白酶和膠原酶對(duì)心肌組織塊進(jìn)行消化，通過觀察細(xì)胞成活率以判定哪種消化酶更適合心肌組織的消化，應(yīng)用0.12％的膠原酶

3、對(duì)心肌組織分別消化5min、10min、15min，確定較好的消化時(shí)間。利用MDM、DMEM/F12、DMEM三種培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞，篩選合適的培養(yǎng)基。結(jié)果表明：貼塊法簡(jiǎn)便、易操作，但是心肌細(xì)胞收獲周期長(zhǎng)，純度相對(duì)較低，酶消化法操作相對(duì)較復(fù)雜，但是細(xì)胞收獲周期短，純度較高，采用差速貼壁和添加Brdu的方法來抑制成纖維細(xì)胞的增殖，能較好的控制心肌細(xì)胞純度；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明，培養(yǎng)的細(xì)胞為心肌細(xì)胞。膠原酶比胰蛋白酶更適合雞心肌組織塊的

4、細(xì)胞分離消化；0.12％的Ⅰ型膠原酶37℃分次消化，每次消化10min能夠較好的分離心肌細(xì)胞；MDM和DMEM/F12培養(yǎng)基比DMEM培養(yǎng)基更適合雞心肌細(xì)胞的培養(yǎng)。 2.將經(jīng)缺錳飼糧飼喂7d的肉仔雞處死后用于雞心肌細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)5～7d長(zhǎng)成單層的心肌細(xì)胞分別加入含0.1、0.5、1.0、2mM/L無(wú)機(jī)硫酸錳的培養(yǎng)基溶液，同時(shí)設(shè)不加錳的對(duì)照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2細(xì)胞培養(yǎng)孔，在加入培養(yǎng)液后的6、12、24、48h時(shí)分別采

5、集細(xì)胞。按照超氧化物歧化酶(SOD)分型測(cè)試盒提供的方法測(cè)定肉仔雞心肌細(xì)胞MnSOD的活性。結(jié)果表明：添加0.1、0.5、1.0mM/L濃度錳的心肌細(xì)胞MnSOD活性與不加錳的心肌細(xì)胞MnSOD活性無(wú)顯著差異，而添加2.0mM/L濃度錳的心肌細(xì)胞MnSOD活性要顯著高于其他各組的MnSOD活性；添加錳后的6～24h里心肌細(xì)胞MnSOD活性變化不大，當(dāng)培養(yǎng)至48h時(shí)心肌細(xì)胞MnSOD活性有明顯升高。由此可知，用2.0mM/L無(wú)機(jī)硫酸錳處理

6、心肌細(xì)胞48h，其MnSOD活性升高最大。 3.將經(jīng)缺錳飼糧飼喂7d的肉仔雞處死后用于雞心肌細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)5～7d長(zhǎng)成單層的心肌細(xì)胞分別加入含0.1、0.5、1.0、2mM幾無(wú)機(jī)硫酸錳的培養(yǎng)基溶液，同時(shí)設(shè)不加錳的對(duì)照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2細(xì)胞培養(yǎng)孔，在加入培養(yǎng)液后的6、12、24、48h時(shí)分別提取細(xì)胞的總RNA。經(jīng)純化后，用熒光定量PCR法對(duì)MnSOD mRNA進(jìn)行定量。結(jié)果表明：用加錳培養(yǎng)基分別培養(yǎng)心肌細(xì)胞6、12、48h