赤霉菌萜類代謝途徑工程基礎(chǔ)研究.pdf

1、作為倍受關(guān)注的有效抗癌藥物紫杉醇，由于含量低、資源匱乏，其藥源問題一直是基因工程天然藥物生產(chǎn)研究的重點(diǎn)。為探索利用次生代謝能力很強(qiáng)的赤霉菌作為宿主菌，通過對(duì)其自身固有代謝途徑的調(diào)控和改造，最終實(shí)現(xiàn)紫杉烯在赤霉菌中的組合表達(dá)，本論文開展了如下基礎(chǔ)性研究：
　　 1.赤霉菌“鯊烯合酶”基因克隆、表達(dá)及功能鑒定
　　 本論文克隆得到赤霉菌鯊烯合酶(Gibberella fujikuroi squalene synthase，G

2、fSQS)基因組序列及cDNA序列編碼區(qū)，通過兩個(gè)序列的比對(duì)分析，結(jié)果表明GfSQS基因組序列全長(zhǎng)1550bp，含有3段內(nèi)含子；GfSQS cDNA序列編碼區(qū)全長(zhǎng)1389bp，編碼462個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量為53.4KD。將克隆得到的GfSQS cDNA編碼區(qū)序列連接到原核表達(dá)載體pET—32(a)上，構(gòu)建帶有His Tag的GfSQS重組表達(dá)載體pET—SQS；并在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，采用IPTG誘導(dǎo)，對(duì)影響蛋白表達(dá)的主要因

3、素進(jìn)行優(yōu)化，表達(dá)產(chǎn)物使用Ni2+柱親和層析方法純化，表達(dá)產(chǎn)物電泳顯示在約70KD處得到目的蛋白條帶，并且在當(dāng)宿主菌OD600達(dá)到0.9—1之間時(shí)加入0.8mMIPTG，在23℃誘導(dǎo)19小時(shí)后可獲得較大量的表達(dá)產(chǎn)物。將純化前后的重組蛋白加入到以FPP為底物的體外酶促反應(yīng)體系中，反應(yīng)產(chǎn)物用正已烷萃取后進(jìn)行GC—MS分析。GC—MS產(chǎn)物化學(xué)分析表明重組pET—SQS表達(dá)產(chǎn)物可以催化FPP產(chǎn)生鯊烯，由此可鑒定GfSQS為赤霉菌鯊烯合酶基因。這項(xiàng)

4、工作的完成為下調(diào)赤霉菌鯊烯合酶基因的表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.赤霉菌取代載體pMD3036FM(e)/HmB轉(zhuǎn)化赤霉菌后，貝殼杉烯合酶(CPS/KS)阻斷變株的篩選
　　 赤霉菌貝殼杉烯合酶基因(cps/ks)取代載體pMD3036FM(e)/HmB含有來自貝殼杉烯合酶基因序列的同源交換臂以及中間插入的潮霉素抗性基因表達(dá)框。對(duì)利用它轉(zhuǎn)化赤霉菌后獲得的一些轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了篩選，一共得到了3個(gè)具有潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化子，它

5、們有可能發(fā)生了3’—單交換。
　　 3.赤霉菌重組貝殼杉烯合酶基因(cps/ks)取代載體pMD3036FM(e)/hph/trpC的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化赤霉菌的初步研究
　　 對(duì)原有取代載體pMD3036FM(e)/HmB進(jìn)行改造，構(gòu)建了新的取代載體pMD3036FM(e)/hph/trpC，該載體的特點(diǎn)為：上游交換臂采用不含任何啟動(dòng)子的部分貝殼杉烯合酶基因編碼序列，與篩選標(biāo)記基因——不含啟動(dòng)子的潮霉素抗性基因相融合。當(dāng)取代載體