銀杏萜內(nèi)酯代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、銀杏萜內(nèi)酯,包括銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯,是在銀杏提取物中起著主要作用的有效藥用成分,其獨(dú)特的生理作用和治療價(jià)值在世界醫(yī)療行業(yè)引起了極大興趣。然而,銀杏萜內(nèi)酯在銀杏中含量較低,且銀杏的細(xì)胞培養(yǎng)系很少產(chǎn)銀杏萜內(nèi)酯。由于不斷擴(kuò)大的銀杏制品的市場(chǎng)需求和有限的銀杏樹(shù)資源,用基因工程技術(shù)修飾銀杏萜內(nèi)酯生物合成途徑已成為提高銀杏萜內(nèi)酯含量最具潛力的方法之一。法尼基焦磷酸合成酶(FPS)是異戊烯基轉(zhuǎn)移酶中的一種,它催化一分子的二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP

2、)和兩分子的異戊烯基焦磷酸(IPP)縮合生成法尼基焦磷酸(FPP)。FPP是植物體內(nèi)甾體、皂苷、倍半萜、橡膠等許多萜類衍生物質(zhì)的合成前體。在銀杏中,FPP為合成白果內(nèi)酯合成提供前體,同時(shí)也為香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的生成提供直接前體,而GGPP是包括銀杏內(nèi)酯在內(nèi)的所有二萜類化合物的共同前體。1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸還原酶(HDR)是MEP途徑末端的酶,以5:1的比例同時(shí)把1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁

3、烯基-4-焦磷酸(HMBPP)轉(zhuǎn)化成IPP和DMAPP的混合物,為銀杏萜內(nèi)酯的生物合成提供了異戊烯前體。FPS和HDR都是銀杏內(nèi)酯合成途徑中的關(guān)鍵酶。因此,fps基因和hdr基因也成為了研究銀杏內(nèi)酯代謝工程的兩個(gè)潛在靶點(diǎn)。為了研究FPS和HDR對(duì)銀杏愈傷中銀杏內(nèi)酯含量的影響,我們基于pCAMBIA1304載體構(gòu)建了兩個(gè)單基因表達(dá)載體,分別是載體p1304+Gbfps和載體p1304+Gbhdr。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,分別將Gbfps和G

4、bhdr轉(zhuǎn)化銀杏種子胚。通過(guò)潮霉素(10mg/L)篩選,分別獲得了32個(gè)和8個(gè)抗性愈傷組織系,PCR檢測(cè)表明其中分別有30個(gè)和7個(gè)為轉(zhuǎn)基因愈傷組織系。采用HPLC-ELSD法分別對(duì)轉(zhuǎn)Gbfps的22個(gè)愈傷組織和轉(zhuǎn)Gbhdr的4個(gè)愈傷組織中的銀杏總內(nèi)酯含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)Gbfps的愈傷組織系f-6中銀杏總內(nèi)酯含量相比非轉(zhuǎn)基因系有大幅提高,達(dá)到非轉(zhuǎn)基因系的4.4倍,轉(zhuǎn)Gbhdr的愈傷組織系h-8中銀杏總內(nèi)酯含量達(dá)到非轉(zhuǎn)基因系的2.