山里紅葉化學(xué)成分及抗脂肪肝作用研究.pdf

1、山里紅葉是薔薇科植物山里紅(Crataegus pinnatifida Bge.var.majorN.E.Br.)的干燥葉,是《中華人民共和國(guó)藥典》2005版收載的山楂葉的一種。本文采用山里紅葉作為研究對(duì)象,采用現(xiàn)代藥理及分析方法,研究了山里紅葉提取物的抗脂肪肝作用及其活性成分。
　　 本研究首先采用復(fù)合方式建立高血脂造成大鼠脂肪肝模型對(duì)山里紅葉提取物預(yù)防脂肪肝的藥理作用進(jìn)行研究。并對(duì)藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明:山里紅葉

2、的70％乙醇提取物對(duì)降脂藥理指標(biāo)均有非常顯著的影響,與模型組相比血清總膽固醇(TC),血清甘油三脂(TG),血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),高密度脂蛋白膽固醇(HDL)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL),肝體比及病理學(xué)檢查等指標(biāo)有顯著變化(P<0.05),結(jié)果說(shuō)明70％乙醇提取物有明顯預(yù)防脂肪肝的作用。提取物經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂處理后,再經(jīng)溶劑萃取,所得的氯仿、正丁醇及水三個(gè)部位提取物進(jìn)行抗脂肪肝藥理作用研究,最后經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)研

3、究證明山里紅葉70％乙醇提取物中的正丁醇萃取層為最佳活性部位。
　　 本研究首次對(duì)山里紅葉抗脂肪肝的最佳活性部位提取的工藝進(jìn)行優(yōu)化,以70％乙醇為溶劑進(jìn)行提取,并對(duì)70％乙醇用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)三個(gè)因素進(jìn)行了考察,篩選最佳提取工藝。目前中藥、天然藥物及活性成分的提取分離和純化常以大孔吸附樹(shù)脂作為處理手段。因此,本研究以總黃酮類成分及出膏率為指標(biāo),對(duì)AB-8、D-101、NKA-9三種型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行了考察,確定以AB-8

4、對(duì)提取物進(jìn)行純化,先用水除去雜質(zhì)后,再采用70％乙醇洗脫總黃酮,減壓回收乙醇,以氯仿、正丁醇分別萃取,確定最佳純化工藝。
　　 為明確山里紅葉提取物抗脂肪肝藥效成分,研究中對(duì)活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離。按山里紅葉活性部位最佳提取工藝,采用70％乙醇作為提取溶劑,經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂處理后,以氯仿、正丁醇分別萃取。正丁醇層提取物以硅膠柱色譜、聚酰胺柱色譜、薄層色譜等技術(shù)進(jìn)行分離純化,運(yùn)用ESI-Ms及NMR等技術(shù)進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒

5、定,并與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)照,由正丁醇層中分離純化得到了9種化合物,其中牡荊素-4'-O-葡萄糖苷,牡荊素-4'-鼠李糖苷為在該植物中首次發(fā)現(xiàn)。
　　 中藥的各種化學(xué)成分是防治疾病的物質(zhì)基礎(chǔ),以一種指標(biāo)性成分的含量測(cè)定作為質(zhì)量控制依據(jù),難以全面反映該藥品藥效。因此,本文首次建立了以HPLC色譜技術(shù),并采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)山里紅葉提取物中8種活性成分同時(shí)測(cè)定,方法先進(jìn)、準(zhǔn)確、可靠。另外標(biāo)準(zhǔn)提取物制定是要以確定藥材采收期作為前提的,故本文以山里葉8

6、種活性成分含量的動(dòng)態(tài)變化為依據(jù),再結(jié)合山里紅葉產(chǎn)率,系統(tǒng)研究了山里紅葉的化學(xué)成分一采收時(shí)間之間相互關(guān)系的動(dòng)態(tài)特征,進(jìn)而確定山里紅葉最佳采收期,為山里紅葉標(biāo)準(zhǔn)提取物研制提供前提保證。
　　 抗氧化與脂肪肝有著密切關(guān)系,為了研究抗脂肪肝作用機(jī)制,本文首次采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)山里紅葉提取物中活性部位主要黃酮類成分牡荊素-2"-O-鼠李糖苷進(jìn)行抗氧化研究。首次采用高效液相色譜法,結(jié)合TBA衍生化技術(shù),定量測(cè)定ECV304細(xì)胞培養(yǎng)液中氧化產(chǎn)

7、物MDA,并根據(jù)氧化產(chǎn)物MDA含量,定量研究牡荊素-2"-O-鼠李糖苷活性成分抗氧化作用能力。研究結(jié)果證明牡荊素-2"-O-鼠李糖苷有較高的保護(hù)ECV304細(xì)胞損害作用,具有較強(qiáng)的抗氧化能力。對(duì)于0.5 mmol·L-1 TBHP誘導(dǎo)氧化細(xì)胞反應(yīng),牡荊素-2"-O-鼠李糖苷在15.6～125μmol·L-1劑量范圍內(nèi)作用24 h,顯著地抑制TBHP誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞氧化,隨著劑量的增加,這種抑制顯著增強(qiáng),結(jié)果證明牡荊素-2"-O-鼠李

8、糖苷最適當(dāng)濃度為62.5μmol·L-1,這說(shuō)明在此濃度內(nèi),該化合物顯示劑量依賴抗氧化效應(yīng),超過(guò)此濃度時(shí),MDA濃度降低緩慢。
　　 本文首次建立了HPLC-UV法測(cè)定牡荊素-2"-O-鼠李糖苷四個(gè)劑量靜脈給藥的大鼠血漿濃度分析方法,以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)測(cè)定血漿中牡荊素-2"-O-鼠李糖苷。結(jié)果表明:大鼠靜脈給藥牡荊素-2"-O-鼠李糖苷的藥物動(dòng)力學(xué)符合二室模型、具有線性動(dòng)力學(xué)特征,這些結(jié)果為其開(kāi)展臨床試驗(yàn)提供了重要的理論依據(jù),有利于

9、臨床給藥方案的設(shè)計(jì)及闡明藥效、副反應(yīng)等。由于黃酮苷類某些成分的特點(diǎn),經(jīng)口服后,化學(xué)成分與腸道菌群發(fā)生相互作用而影響藥物吸收,再則由于分析儀器靈敏度的限制等因素,因此,文獻(xiàn)報(bào)道口服給藥山里紅葉活性成分體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究較少。本文首次建立了UPLC-MS/MS法測(cè)定口服給藥山里紅葉提取物及單體牡荊素-2"-O-鼠李糖苷大鼠血漿中牡荊素-2"-O-鼠李糖苷的分析方法,專屬性強(qiáng),靈敏度高,分析速度快,有良好的精密度及準(zhǔn)確度,非常適用于牡荊素-2

10、"-O-鼠李糖苷藥代動(dòng)力學(xué)研究。樣品僅需一步萃取,操作簡(jiǎn)單,定量下限為10 ng·mL-1,其檢測(cè)限可達(dá)2 ng·mL-1,每個(gè)樣品分析時(shí)間僅需3.0min,為研究山里紅葉提取物及活性成分在大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究提供了可靠的分析手段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:牡荊素-2"-O-鼠李糖苷在大鼠體內(nèi)360min內(nèi)基本消除,灌胃給藥牡荊素-2"-O-鼠李糖苷與山里紅葉提取物相比,其吸收達(dá)峰時(shí)間基本一致,血漿中檢測(cè)到牡荊素-2"-O-鼠李糖苷濃度較低,Cm

11、ax和AUC較小,其他藥動(dòng)參數(shù)與提取物給藥基本一致。牡荊素-2"-O-鼠李糖苷在大鼠血漿中藥-時(shí)曲線符合二室模型的一級(jí)吸收。
　　 總之,本研究是多學(xué)科技術(shù)相結(jié)合,研究了山里紅葉提取物抗脂肪肝作用及其活性成分,研究結(jié)果可為山里紅葉的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為中藥的現(xiàn)代化研究進(jìn)行了有意義的探索。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)牡荊素-2"-O-鼠李糖苷的抗氧化和體內(nèi)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究,其他成分尚需進(jìn)一步研究,以全面闡明山里紅葉提取物中活性成分與藥理作用的密