瘢痕疙瘩差異表達基因的篩選及標志蛋白的分析.pdf

1、研究背景及目的： 瘢痕疙瘩是人類特有的一種病理現(xiàn)象，由其產(chǎn)生的畸形和功能障礙在臨床上時常遇到，是美容、整形外科最棘手的問題之一。瘢痕疙瘩不同于一般的瘢痕組織，具有過度生長、超過原傷口界限、侵犯臨近組織呈瘤樣增生，而且有自始自終不退化，單純手術切除易復發(fā)等特點。至今瘢痕疙瘩的病因還不清楚，因此治療也沒有特別有效的方法。如何尋找并闡明瘢痕疙瘩病因，是最終徹底治愈瘢痕疙瘩唯一有效方法。關于瘢痕疙瘩的病因，人們一直在努力探究，做了大量的

2、研究。從各個方面、各個角度來闡明瘢痕疙瘩的病因，如從瘢痕疙瘩發(fā)生與傷口受到較大張力牽引，提出的力學和機械學說；從瘢痕疙瘩處于缺血缺氧狀態(tài)提出的缺血學說；還有免疫反應學說，膠原合成與降解失衡學說，細胞因子學說、細胞凋亡異常學說以及遺傳學說等等，這些學說都從一個方面說明了瘢痕疙瘩與這些因素之間有著或多或少的聯(lián)系，但都不能完全說明瘢痕疙瘩發(fā)生的確切病因。如何從整體考量、全面分析基因來捕捉瘢痕疙瘩致病基因，而不是主觀臆定某一基因或因子作為研究對

3、象，是尋找瘢痕疙瘩病因的關鍵所在。 人類23對染色體大約含有10萬個基因，其中大約只有15％表達于個體細胞。基因的選擇性表達決定了有機體的發(fā)育和分化等各項生命活動。不僅如此，多種因素造成的基因表達改變，單基因突變或多基因協(xié)同作用，均可改變有機體的正?；顒?，導致疾病的發(fā)生。所以，比較病變組織與正常組織中基因表達的差異，對疾病的診斷和治療具有重要意義。該實驗利用抑制消減雜交(SSH)技術，對瘢痕疙瘩與正常皮膚組織進行差異基因篩選。正

4、是利用分子雜交的原理去除雙方共同的序列，分離出兩種組織間差異表達的基因。另外，利用蛋白指紋圖譜(SELDI)技術檢測瘢痕疙瘩差異蛋白。這些差異表達的基因及蛋白將為尋找瘢痕疙瘩發(fā)生的病因提供有力的線索。 方法： 1.收集瘢痕疙瘩標本，經(jīng)臨床及病理診斷，分別取瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織，并迅速保存于液氮中。 2.利用Clontech公司的消減抑制雜交試劑盒(ClontechPCR-SelectcDNASubtract

5、ionKit)進行實驗。 3.首先提取瘢痕疙瘩和正常皮膚組織總RNA，再進一步提取其中的mRNA。 4.以提取的mRNA為模板，逆轉錄合成瘢痕疙瘩和正常皮膚cDNA。瘢痕疙瘩cDNA作為實驗方(tester)，正常皮膚cDNA作為雜交驅動方(driver)。 5.為了使DNA分子雜交時機會均等，使大小長度不一的cDAN分子片段基本相等，用RsaⅠ酶切，得到500bp左右大小cDNA片段。 6.瘢痕疙瘩cD

6、NA分成兩組，分別連接特殊設計的接頭：adaptor1和adaptor2R。 7.經(jīng)過兩次消減雜交，差異表達的基因片段兩端分別帶有adaptor1和adaptor2R。 8.再經(jīng)過兩次PCR擴增。第一次PCR時只有模板片段兩端連接有兩個不同接頭的雙鏈cDNA才得以指數(shù)擴增。第二次PCR實際上是巢式PCR，極大地提高了擴增片段的特異性。 9.消減雜交后PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定。利用T載體進行PCR產(chǎn)物的克隆，挑選出陽

7、性克隆。進行PCR鑒定，證實克隆T載體中攜帶了目的基因片段。 10.Southern雜交驗證篩選出的差異基因。 11.挑選Southern雜交陽性的克隆送基因測序。測序結果與GeneBank做對比，分析所得基因的結構、功能等相關信息。 12.利用蛋白指紋技術(SELDI)，初步分析瘢痕疙瘩差異表達的蛋白。 結果： 1.瘢痕疙瘩和正常皮膚組織總RNA，于1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，顯示28S條帶比1

8、8S條帶亮2倍以上，說明提取的總RNA質(zhì)量好，沒有降解。 2.瘢痕疙瘩和正常皮膚mRNA經(jīng)逆轉錄cDNA第一鏈和第二鏈合成雙鏈cDNA，經(jīng)RsaⅠ酶切，結果顯示酶切后片段大小分布在0.2～1.5kb之間，明顯比未經(jīng)酶切的對照短，說明酶切較完全。 3.利用PCR的方法分析接頭的連接效率。可以看到看家基因G3PDH的3’引物和PCR引物1的產(chǎn)物，同基因G3PDH特異性引物(G3PDH的3’和5’引物)所擴增的PCR產(chǎn)物強度比

9、值高于1：4，說明接頭連接效率至少達到25％，可用于消減雜交。 4.第1次PCR后，在消減后的樣品中呈現(xiàn)200～750bp左右的彌散帶，未見明顯的的特異性擴增帶。而在未消減的樣品中可見范圍更寬的彌散帶，也未見明顯的特異擴增帶。利用巢式引物進行的第2次PCR擴增后，在消減后的樣品中可見明顯特異擴增的條帶，而未消減的樣品沒有出現(xiàn)特異擴增條帶。試劑盒提供的陽性對照擴增條帶進一步明顯，與說明書中的描述一致。兩次PCR擴增非常成功。

10、 5.消減雜交得到的PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉化感受態(tài)細胞，涂平板得到克隆菌落。隨機挑取克隆做PCR檢測，其中克隆陽性率85％。大部分陽性克隆PCR擴增片段大小范圍在250～750bp內(nèi)，主要集中在500bp左右。這個結果和實驗設計時預計的克隆片段在500bp左右相符合。 6.進一步的Southern雜交顯示有20個差異表達基因。這些基因經(jīng)測序，序列與GeneBank做比對，分析基因結構和功能。初步篩選出了20個在瘢痕疙瘩中表

11、達高于在正常皮膚中表達的基因片斷。經(jīng)過核苷酸序列測定及同源性分析，11個與已知功能的基因高度同源，9個為未知功能基因。在已知功能基因的片段中有與DAN轉錄、翻譯有關的基因如BTAF1基因、E4TF1基因等；有與細胞增殖、遷徙有關的基因如EPHB2基因、PDGFR基因等；有與腫瘤發(fā)生有關的基因如GAGE-7B基因等。 8.利用蛋白指紋技術(SELDI)，發(fā)現(xiàn)數(shù)種瘢痕疙瘩差異表達的蛋白。 結論： 1.利用消減抑制雜交