鄰苯二甲酸單甲酯單克隆抗體的制備及試劑盒的研制.pdf

1、鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)是聚氯乙烯等塑料制品的增塑劑成分，同時(shí)它還是紡織纖維類潤(rùn)滑劑及膠粘合劑的重要工業(yè)原料。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，塑料制品的用途日益廣泛，塑料、紡織纖維和粘合劑等這些材料又是我們?nèi)粘Ｉ钪械某Ｒ娙沼闷?，因此，PAEs在現(xiàn)代生活中隨處可見。由于PAEs具有很難被分解和累積效應(yīng)的特點(diǎn)而通過(guò)食物鏈和水循環(huán)而進(jìn)入環(huán)境中。臺(tái)灣的增塑劑風(fēng)波使得更多的人們非常關(guān)注PAEs。研究發(fā)現(xiàn)，PAEs為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有生殖毒性、致

2、癌、致畸等遺傳毒性，因而各國(guó)均加強(qiáng)了對(duì)該物質(zhì)的檢測(cè)力度。
　　目前，PAEs常用的檢測(cè)方法有液相色譜法、氣相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用等，這些方法均能在一定濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)PAEs的檢測(cè)，但是使用上述這些方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)大多要對(duì)樣品進(jìn)行處理，且檢測(cè)的過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)事，成本較高，靈敏度較低。因此，建立一種省時(shí)省力、成本較低的檢測(cè)方法迫在眉睫。
　　酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)具有對(duì)檢測(cè)樣品的專一性，同時(shí)樣品處理過(guò)程較為簡(jiǎn)單，

3、檢測(cè)成本較低，可以一次性檢測(cè)多個(gè)樣品，且靈敏度高。因此，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)能很好地解決上述物理、化學(xué)檢測(cè)中存在的這些問(wèn)題，但是ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵問(wèn)題是首先要有PAEs相應(yīng)的抗體。
　　鄰苯二甲酸單甲酯(MMP)是PAEs中的一種，為建立MMP的ELISA檢測(cè)方法，本研究以4-硝基鄰苯二甲酸酐和甲醇為原料合成4-氨基鄰苯二甲酸單甲酯，即半抗原，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)方法將半抗原分別連接載體蛋白OVA和BSA，得到人工抗原MMAP-O

4、VA，MMAP-BSA，MMCP-OVA，MMCP-BSA。將人工抗原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，同時(shí)進(jìn)行效價(jià)及抑制率的測(cè)定，通過(guò)細(xì)胞融合的方法制備雜交瘤細(xì)胞，對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選及克隆化，建立MMP單克隆細(xì)胞株，制備MMP單克隆抗體并利用該抗體進(jìn)行試劑盒的研制。
　　研究結(jié)果表明:通過(guò)采用紫外光譜法和SDS-PAGE法鑒定人工抗原的合成時(shí)成功的。在第五次免疫后對(duì)小鼠的血清進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得MMCP-BSA組小鼠的效價(jià)均達(dá)到了105以上，達(dá)到了免疫

5、的要求。對(duì)該組小鼠的血清采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)得IC50為115μg/L。以上結(jié)果顯示小鼠免疫效果良好，符合細(xì)胞融合的要求。通過(guò)細(xì)胞融合和對(duì)雜交瘤細(xì)胞的篩選試驗(yàn)獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株。對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)行染色體分析得到其染色體條數(shù)為97～103條，證明該融合是成功的。對(duì)該抗體進(jìn)行性質(zhì)鑒定測(cè)得其蛋白質(zhì)含量為3.75 mg/mL。在抗體制備成功的基礎(chǔ)上進(jìn)行試劑盒的制備，采用間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)得當(dāng)MMP濃度在10.43～264.72μg/L時(shí)