抗牛布氏桿菌單克隆抗體的制備及cELISA檢測試劑盒研制.pdf

1、布氏桿菌病(Brucellaellosis)也稱布魯菌病（布?。怯刹际蠗U菌感染引起的一種最為常見的人獸共患傳染病之一，其中又以牛種和羊種布氏桿菌最為嚴(yán)重。布氏桿菌被列為必須報(bào)告病原體，除了少數(shù)已經(jīng)根除布病的國家，布病廣泛地分布于世界各地，我國也是布病流行極為嚴(yán)重的國家之一。最近幾年，布病在世界范圍內(nèi)呈反彈趨勢(shì)，給公共衛(wèi)生安全及畜牧業(yè)發(fā)展而帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，布病防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。由于目前尚未有理想的治療藥物，因此對(duì)布病的準(zhǔn)確診斷是

2、預(yù)防該病的關(guān)鍵。目前對(duì)布病的檢測方法主要是血清學(xué)方法，包括試管凝集試驗(yàn)(SAT)、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和熒光偏振免疫分析法(FPIA)等。但是由于布氏桿菌的脂多糖(LPS)與另外一些革蘭陰性菌，特別是耶爾森菌O9和大腸桿菌O157表面的LPS的結(jié)構(gòu)存在相似成分，因此在檢測中往往會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性的檢測結(jié)果。鑒于此，本研究制備了具有特異性的抗牛種布氏桿菌的單克隆抗體，并且利

3、用該單克隆抗體建立了檢測布氏桿菌抗體的競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)方法，通過與商品化布病檢測試劑盒的比較，證明本研究的cELISA方法能夠有效地排除以耶爾森菌O9和大腸桿菌O157為代表的典型革蘭氏陰性菌引起的假陽性的結(jié)果，在布病根除計(jì)劃中將具有重要應(yīng)用價(jià)值。
　　1.抗布氏桿菌單克隆抗體的研制及特性鑒定
　　本研究用滅活的牛種布氏桿菌S2308免疫BALB/c小鼠，按常規(guī)方法免疫三次后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取小鼠脾細(xì)胞與骨

4、髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。將牛種布氏桿菌A99、耶爾森菌O9和大腸桿菌O157分別包被酶標(biāo)板，用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(iELISA)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，結(jié)果獲得2株穩(wěn)定分泌抗布氏桿菌抗體的雜交瘤細(xì)胞株Brucella-5C10和Brucella-4D2。對(duì)該2株雜交瘤進(jìn)行特性分析，結(jié)果表明，Brucella-5C10腹水效價(jià)為1∶64000，亞類鑒定為IgG3/λ; Brucella-4D2腹水效價(jià)為1∶32000，亞類鑒定為IgG3/λ

5、。試管凝集試驗(yàn)結(jié)果表明，2株單克隆抗體與牛種布氏桿菌S2308、牛種布氏桿菌A99、羊種布魯氏菌16M能發(fā)生較強(qiáng)凝集作用;而與耶爾森菌O9、大腸桿菌O157無明顯凝集現(xiàn)象。免疫印跡法(Western-blot)結(jié)果顯示，該2株單克隆抗體與布氏桿菌菌體蛋白具有明顯反應(yīng)性，而與耶爾森菌O9、大腸桿菌O157無明顯反應(yīng)。本研究所獲得的2株單克隆抗體為組建檢測動(dòng)物血清中布氏桿菌抗體的cELISA試劑盒提供了優(yōu)良的生物材料。
　　2.布氏桿

6、菌抗體競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)檢測試劑盒的研制
　　為檢測待檢血清中布氏桿菌抗體，利用牛種布氏桿菌A99作為抗原包被酶標(biāo)板，利用Brucella-5C10作為競爭抗體，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為第二抗體組建了cELISA試劑盒。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)牛種布氏桿菌A99按4μg/孔包被;單克隆抗體按1∶4000稀釋;待檢血清按1∶20稀釋;酶標(biāo)二抗按1∶10000作為工作濃度時(shí)本研究建立的cELISA方法檢測結(jié)果最適。通

7、過ROC分析，本研究建立的cELISA方法確定抑制率30％作為臨界值，其敏感性(DSn)和特異性(DSp)在95％置信度(CI)下分別為93.3％和96.2％。用本研究建立的cELISA方法檢測臨床樣品320份牛血清和147份羊血清，并與商品化布病cELISA檢測方法作比較。結(jié)果表明，兩種cELISA方法共同檢測出牛血清樣品中167份陽性和139份陰性，出現(xiàn)了14份差異樣品，符合率為95.6％;共同檢測羊血清樣品112份陽性和24份陰性

8、，出現(xiàn)了11份差異樣品，符合率為92.5％。進(jìn)一步用CFT驗(yàn)證其中的25份差異樣品，結(jié)果本研究建立的cELISA與CFT符合率為85％(21/25)。另外，利用該方法檢測牛羊種耶爾森菌O9的高免血清，結(jié)果證明當(dāng)高免血清的抗體濃度小于200IU/ml時(shí)，本研究組建的cELISA試劑盒不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
　　綜上所述，本研究建立的cELISA檢測試劑盒具有良好的特異性和靈敏度，能夠更好的排除由典型的交叉菌耶爾森菌O9和大腸桿菌O15