維持血透的腎衰患者血清HO-1血清及炎癥因子改變的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：尿毒癥患者體內(nèi)活性氧產(chǎn)生過多和機體抗氧化功能不全所導(dǎo)致的組織氧化應(yīng)激損傷，是慢性腎衰竭的主要特征，對長期血液透析的終末期腎衰患者血管硬化起到促進(jìn)作用，反映尿毒癥患者體內(nèi)氧化應(yīng)激的生物標(biāo)記物種類繁多，目前認(rèn)為最有代表意義的氧化應(yīng)激標(biāo)記物是MDA，據(jù)文獻(xiàn)報道未達(dá)到血透指征的CRF患者血漿中MDA水平明顯高于健康對照組，并且隨著腎功能衰退的進(jìn)程而進(jìn)行性升高，進(jìn)行血透的CRF患者M(jìn)DA水平又明顯高于未血透者，而CRF患者血漿中的MDA水平

2、在透析過程中進(jìn)行性下降，患者血清MDA的升高同CRP以及冠狀動脈硬化的進(jìn)展程度顯著相關(guān)，以上研究均表明腎衰患者隨著病程進(jìn)展，氧化應(yīng)激的水平呈上升趨勢；與氧化應(yīng)激相關(guān)的動脈粥樣硬化是影響尿毒癥患者生存質(zhì)量的主要并發(fā)癥之一，目前認(rèn)為慢性炎癥狀態(tài)與動脈粥樣硬化同樣密切相關(guān)，許多論據(jù)支持“動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病”這一論點并且達(dá)成共識，其中C反應(yīng)蛋白(CRP)是慢性炎癥狀態(tài)最敏感的指標(biāo)，并且CRP水平與尿毒癥血液透析患者營養(yǎng)狀態(tài)有密切的相關(guān)

3、性，而高同型半胱氨酸血癥是引起血管疾病的一個獨立的重要的危險因子，被認(rèn)為是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的因素之一；相反，HO-1作為一種最廣泛存在的抗氧化防御酶，被證實具有保護(hù)血管功能的作用，能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其免于受到氧化應(yīng)激和炎癥等因素的損傷，目前國內(nèi)有關(guān)血紅素氧化酶的動物實驗研究較多：通過微波照射預(yù)處理對誘導(dǎo)兔肝HO-1的實驗研究，表明HO-1可能對肝臟缺血再灌注損傷起著重要的作用：通過轉(zhuǎn)染HO-1基因大鼠肝細(xì)胞系B

4、RL體外抗凋亡作用的研究證實HO-1表現(xiàn)出較強的抗凋亡能力；通過離體培養(yǎng)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞低氧預(yù)處理研究證實Ho-1mRNA被顯著誘導(dǎo)并維持在較高水平；通過研究證實梗阻性黃疸大鼠肺HO-1mRNA高表達(dá)有助于減輕梗阻性黃疸所引起的肺損害等等；通過建立容量負(fù)荷過重sD大鼠模型并給予氯沙坦治療研究發(fā)現(xiàn)HO-1在調(diào)節(jié)血壓和血管重構(gòu)方面有重要作用等等：目前臨床上關(guān)于HO-1在老年人急性心肌梗死(AMI)患者中的表達(dá)研究證實老年人AMI時HO-

5、1表達(dá)水平明顯升高；通過對血紅素氧化酶-1、2及內(nèi)皮素-1在妊娠高血壓綜合征患者胎盤組織中的表達(dá)及作用的研究提示血紅素氧化酶的表達(dá)減少可能在妊高征的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用等；而維持血透慢性腎衰患者的HO-1血清表達(dá)變化的研究尚有很多空白。 目的：本課題探討有關(guān)維持血透的腎衰患者血清中血紅素氧化酶-1(HO-1)與C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、同型半胱氨酸(Hcy)、脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)等的血清

6、水平同對照人群的差異以及與上述指標(biāo)在血液透析前后的變化，為臨床上應(yīng)用血紅素氧化酶誘導(dǎo)劑防治腎衰患者的血管硬化等并發(fā)癥提供一定的依據(jù)。 方法：實驗于2006年5月至6月在解放軍305醫(yī)院中心實驗室完成，選擇2006-01/2006-03在解放軍總醫(yī)院第二附屬醫(yī)院以及解放軍305醫(yī)院血液凈化中心進(jìn)行常規(guī)透析的慢性腎衰竭患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：1．患者血清肌酐等指標(biāo)符合終末期腎衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)；2．患者透析時間在3個月以上，愿意接受此項實驗并簽

7、署知情同意書；3．無嚴(yán)重合并癥存在間共收入符合條件患者26例，男17例，女9例，年齡27～55歲，原發(fā)病病因為：慢性腎小球腎炎12例，慢性間質(zhì)性腎炎5例，成人型多囊腎3例，高血壓病2例，糖尿病腎病l例，原因不明3例；以上病例按透析年限(3年以內(nèi)和3年以上)分為長期組和短期組，每組各13例，其中長期組男性7例，女性6例，短期組男性10例，女性3例，兩組患者性別年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。透析方式：所有患者均給予碳酸氫鹽透析，

8、透析液鈣1.5mmol/L，每周2～3次，每次4h，血管通路自體動靜脈內(nèi)瘺，透析器采用聚砜膜(F6)，均不復(fù)用，上述患者在一周內(nèi)分別于血液透析前后靜脈取血，離心分出血清后于-20℃凍存；對照組：選取年齡及性別匹配的解放軍三零五醫(yī)院體檢人員24例組成，均為無心肺疾患，肝腎功能正常的人員，其中男12例，女12例，年齡24～49歲，靜脈取血、離心后血清于-20℃凍存；患者組與對照組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。取血前后采集所

9、有人員相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)，并定量檢測患者組血透前后和對照組的實驗室指標(biāo)：(1)應(yīng)用Canada Stressgen Bioreagents Corporation的HLimam Ho-1ELISA Kit通過ELISA方法定量測定血清Ho-1水平：具體步驟包括配制標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌Buffer、稀釋Ho-1抗體、配制抗兔IgG HRP結(jié)合物稀釋液，準(zhǔn)備工作完成后使用Organon Teknika microwell system全自動酶免疫分析儀

10、進(jìn)行測定(加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品、使用洗滌緩沖液反復(fù)洗滌6次、加抗人HO-1抗體孵育后再次洗滌、加入抗兔IgG HRP結(jié)合物后洗板、然后加入TMB底物顯色液和終止液終止反應(yīng))，450nm波長下測出各管的吸光度和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各管測定結(jié)果；(2)采用France Diaclone Bioreagents Corporation的High sensitivityhuman IL-6 ELISA KIT測定血清IL-6水平，具體步驟如下：用標(biāo)準(zhǔn)

11、品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到50pg/ml為主液，然后再用該主液稀釋到各標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行稀釋配制Control液，稀釋生物素化IL-6抗體、用蒸餾水進(jìn)行200倍稀釋洗滌緩沖液，稀釋抗生蛋白鏈霉素-HRP，使用Organon Teknika microwellsystem全自動免疫分析儀，進(jìn)行免疫分析測定(根據(jù)標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)、空白及質(zhì)控數(shù)量決定使用板條孔數(shù)、程序設(shè)定、添加生物素化的IL-6抗體并振蕩、保溫3小時、緩沖液洗板6次、將各管分別加入

12、制備的抗生物蛋白的鏈霉素化的HRP并振蕩、在室溫下保溫30分鐘、緩沖液洗板6次、每孔加入制備的基質(zhì)液TMB并保溫25分鐘、加入終止液H<,2>SO<,4>到各孔中、終止反應(yīng))，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出實驗結(jié)果；(3)使用BECKMAN IMMAGE免疫化學(xué)自動分析系統(tǒng)及專用試劑盒測定血清CRP水平，大致步驟如下：按IMMAGE分析儀的要求，將樣品、質(zhì)控品和試劑分別置于固定的位置，按順序和體積由儀器自動加入相應(yīng)的試劑(樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、CR

13、P抗體、緩沖液、稀釋液)，儀器自動檢測出抗原抗體蛋白復(fù)合物濁度并計算出結(jié)果；(4)使用AxSYM Homocysteine assay機器及配套試劑，采用熒光偏振法(FPIA)測定血清Hcy水平，步驟如下：試劑準(zhǔn)備(含熒光標(biāo)記SAH的示蹤劑、含SAH-hydrolase磷酸鹽緩沖液、鼠抗SAH單克隆抗體、含DTT和adensine的預(yù)處理液、稀釋液、AxSYM HCY校正液、AxSYM HCY質(zhì)控液)，使用AxSYM System全自動

14、免疫分析儀進(jìn)行分析(定標(biāo)、質(zhì)控、樣品申請、放置樣品、試劑裝載、檢查樣品的類型和完整度，檢查上機庫存和廢物量，檢查測試所需的樣品量和消耗品量是否足夠，檢查上機試幫、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、纖維杯和大瓶緩沖液的效期，所有檢查結(jié)束后開始啟動測定并自動讀數(shù))；(5)MDA的血清水平測定，步驟入下：試劑配制(無水乙醇、冰醋酸、試劑一：試劑盒自帶，20ml/瓶，觀察無凝塊、無懸浮物；試劑二：12ml/瓶，取一500ml試劑瓶，裝340ml蒸餾水徹底溶解；試

15、劑三：粉劑一只，先用500ml三角燒瓶將60ml蒸餾水煮沸，將粉劑倒入其中，然后再繼續(xù)加熱直至完全溶解，再加60ml冰醋酸；標(biāo)準(zhǔn)品：四乙氧醛丙烷10nmol/ml，5ml/1瓶)，使用BECKMAN Du530DNA/protein Analyzer比色計進(jìn)行測定，測試步驟(所有試劑均使用microlab500 series加樣器加樣、搖動試管架使試管內(nèi)試劑混勻、用錫紙薄膜將全部試管覆蓋好，在每個試管上方扎幾個小孔，以便蒸汽流通，置入9

16、5℃恒溫水浴箱中保溫40分鐘、取下薄膜后離心3500轉(zhuǎn)/分鐘共15分鐘、用BECKMANDu530 DNA/protein Analyzer比色計進(jìn)行比色，λ=532nm，蒸餾水調(diào)“0”，以“0”和10nmol/ml兩點做標(biāo)準(zhǔn)曲線)。 結(jié)果：(I)維持血透的腎衰患者透析前血清HO-1、IL-6、CRP、Hcy水平較對照人群明顯升高，與對照組相比差別顯著(P<0.01)；(2)患者組血液透析治療前后上述部分指標(biāo)血清水平有明顯改變，

17、IL-6、Hcy血清水平明顯下降(P<0.05)：(3)長期組患者血透前后上述指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)：(4)短期組患者血透后Hcy水平低于血透前(P<0.01)，其它指標(biāo)血透前后均無顯著性差異(P>0.05)；(5)長期與短期血透組透析前上述指標(biāo)的血清水平均無顯著性差異。 結(jié)論：維持血透的腎衰患者血清HO-1與CRP、IL-6、Hcy等指標(biāo)的血清水平較對照人群均明顯升高，提示腎衰患者體內(nèi)炎癥水平、血管硬化損傷等血清水